李瑾昱，焦順昌，張國(guó)慶，孫勝杰

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100853

表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)水平對(duì)西妥昔單抗及其介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用殺傷肺腺癌A549細(xì)胞的影響

李瑾昱，焦順昌，張國(guó)慶，孫勝杰

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100853

目的探討表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)表達(dá)水平對(duì)西妥昔單抗及其介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 (ADCC)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞殺傷的影響。方法以肺腺癌A549細(xì)胞作為靶細(xì)胞，NKTm細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，將pEGFR-EGFP質(zhì)粒用核轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入A549細(xì)胞，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組與野生組A549細(xì)胞表面EGFR蛋白的表達(dá)水平。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8法檢測(cè)西妥昔單抗以及西妥昔單抗介導(dǎo)的ADCC作用對(duì)轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞與野生組A549細(xì)胞的體外殺傷率。結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，野生組A549細(xì)胞EGFR表達(dá)呈弱陽(yáng)性，而轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞EGFR表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。西妥昔單抗介導(dǎo)的ADCC作用對(duì)轉(zhuǎn)染后高表達(dá)EGFR的A549細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用 (P＜0．05)，而西妥昔單抗單獨(dú)作用時(shí)，轉(zhuǎn)染組與野生組間的殺傷率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)。結(jié)論細(xì)胞表面EGFR蛋白的表達(dá)水平能夠影響西妥昔單抗介導(dǎo)的ADCC作用對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的殺傷，而對(duì)西妥昔單抗本身的殺傷作用無(wú)影響。

西妥昔單抗;非小細(xì)胞肺癌;表皮生長(zhǎng)因子受體

Acta Acad Med Sin，2014，36(2)：164-167

西妥昔單抗是抗表皮生長(zhǎng)因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)人/鼠嵌合型lgG1單克隆抗體，可以通過(guò)阻斷內(nèi)源性配體介導(dǎo)的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制腫瘤的生長(zhǎng)。此外，西妥昔單抗還能夠通過(guò)發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)作用介導(dǎo)淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及胞內(nèi)毒性物質(zhì)，殺傷腫瘤細(xì)胞［1］。大規(guī)模臨床研究證實(shí)與單純化療相比，聯(lián)合西妥昔單抗能夠延長(zhǎng)患者的總生存期［2-3］。然而作為靶向藥物的西妥昔單抗在非小細(xì)胞肺癌的治療中尚缺乏有效的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)。EGFR是西妥昔單抗發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵，研究表明腫瘤細(xì)胞高表達(dá)EGFR的非小細(xì)胞肺癌患者，在一線化療方案中加用西妥昔單抗可能取得更好的療效［4-5］。但EGFR表達(dá)水平是否真的能夠預(yù)測(cè)西妥昔單抗聯(lián)合化療的療效仍需前瞻性臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。本研究在細(xì)胞水平上探討EGFR表達(dá)水平對(duì)西妥昔單抗以及其介導(dǎo)的ADCC作用殺傷肺癌細(xì)胞的影響。

材料和方法

材料西妥昔單抗注射液 (德國(guó)默克公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、無(wú)菌磷酸鹽緩沖液、胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司);胰蛋白酶-EDTA消化液 (美國(guó)AMRESCO公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(日本Dojindo laboratories公司);DH5α(美國(guó)GIBICO公司);細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒T(德國(guó)Amaxa Biosystems公司)。HERA Safe KS-12型生物安全柜、HERA Cell 240型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、SORVALL LEGEND MACH 1．6R 離心機(jī)、Multiskan MK3酶標(biāo)儀 (美國(guó)Thermo公司);Olympus BX41正置顯微鏡、Olympus CKX41倒置顯微鏡 (日本Olympus公司);Cytometer FC 500 MPL流式細(xì)胞儀(美國(guó) BECKMAN公司);Veriti 96well梯度 PCR儀(Applied Biosystems公司);Amaxa Nucleofector system電轉(zhuǎn)儀 (德國(guó) Amaxa Biosystems公司)。人肺腺癌A549細(xì)胞為我室常規(guī)凍存;NKTm細(xì)胞由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室林星石教授培養(yǎng)并提供;pEGFR-EGFP質(zhì)粒由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫研究所沈關(guān)心教授惠贈(zèng)。

靶細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞的制備A549細(xì)胞用RPMI/1640培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液。NKTm細(xì)胞由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室制備，具體培養(yǎng)方法參見本實(shí)驗(yàn)室方法［6］。

pEGFR-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞將6孔板每孔加入1．5 ml培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中預(yù)熱至37℃;添加劑與核轉(zhuǎn)染溶液按1∶4．5的比例混合至100 μl;收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞1×106個(gè)，用上述100 μl混合液重懸細(xì)胞，充分混勻;加入2 μg pEGFR-EGFP質(zhì)粒;迅速將液體移入電轉(zhuǎn)杯中，蓋好杯蓋放入電轉(zhuǎn)儀中，選擇程序“A549 X-001”;按啟動(dòng)鍵，將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至A549細(xì)胞后迅速將細(xì)胞混合液移入6孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄上清，胰蛋白酶常規(guī)消化后用完全培養(yǎng)基中和，1 500 r/min，轉(zhuǎn)矩300 N·m，離心5 min后棄上清，PBS溶液重懸后清洗3遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

EGFR免疫組織化學(xué)檢測(cè)將轉(zhuǎn)染組及野生組A549細(xì)胞懸液分別滴到不同載玻片上，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)好的細(xì)胞玻片用PBS緩沖液漂洗2 min×3次。4%多聚甲醛室溫固定后滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加抗EGFR一抗，置于37℃烤箱孵育1 h后向細(xì)胞上滴加適量二抗工作液，置于保濕盒內(nèi)37℃烤箱孵育30 min。避光條件下二氨基聯(lián)苯胺顯色并蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察染色及分化程度，最后乙醇脫水及封片。

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8法檢測(cè)A549細(xì)胞的抑制率將野生組A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞分別按50個(gè)/μl接種于96孔板，每孔中的液體量為100 μl。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h;待其完全附壁后，加入西妥昔單抗 (終濃度0．05 g/L)，待藥物作用18 h后再加入1 250 個(gè)/μl的 NKTm 細(xì)胞100 μl(效靶比為25∶1)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8試劑10 μl，2 h后用酶標(biāo)儀 (測(cè)定波長(zhǎng)450 nm)測(cè)定每孔光密度 (optical density，OD)值，最后結(jié)果取均值，以未處理組作為對(duì)照組，重復(fù)3次。

抑制率的計(jì)算西妥昔單抗對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率=1-(西妥昔單抗組OD值/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值)×100%;聯(lián)合作用對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率=［靶細(xì)胞對(duì)照組OD值-(聯(lián)合作用組OD值-NKTm細(xì)胞對(duì)照組OD值)］ /靶細(xì)胞對(duì)照組OD值×100%;NKTm細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率=［靶細(xì)胞對(duì)照組OD值-(NKTm細(xì)胞組OD值-NKTm細(xì)胞對(duì)照組OD值)］/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值×100%。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間差異采用秩和檢驗(yàn)分析方法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

轉(zhuǎn)染后EGFR蛋白表達(dá)情況應(yīng)用核轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFR-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，流式細(xì)胞儀測(cè)得轉(zhuǎn)染率為22．3%。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，野生組的A549細(xì)胞EGFR表達(dá)呈弱陽(yáng)性 (1+)，轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞EGFR表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性 (3+)，且多為膜陽(yáng)性(圖1)。

EGFR表達(dá)水平對(duì)ADCC作用的影響分別以野生組的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后高表達(dá)EGFR分子的A549細(xì)胞作為靶細(xì)胞，西妥昔單抗聯(lián)合NKTm細(xì)胞以及單獨(dú)西妥昔單抗、單獨(dú)NKTm細(xì)胞分別對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷作用，結(jié)果顯示西妥昔單抗介導(dǎo)NKTm細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染后高表達(dá)EGFR的A549細(xì)胞的抑制率顯著高于野生組 (52．74 ±6．30 比 41．76 ±3．45，P ＜0．05)，而西妥昔單抗單藥及NKTm細(xì)胞單獨(dú)作用對(duì)EGFR表達(dá)水平不同的A549細(xì)胞的抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)(表 1)。

圖1 EGFR免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (×20)Fig 1 Immunohistochemical staining for EGFR expression(×20)

表1 西妥昔單抗介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用對(duì)不同A549細(xì)胞的抑制率 (±s，%)Table 1 Inhibition rate of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity mediated by cetuximab on different A549 cells(x－ ± s，%)

表1 西妥昔單抗介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用對(duì)不同A549細(xì)胞的抑制率 (±s，%)Table 1 Inhibition rate of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity mediated by cetuximab on different A549 cells(x－ ± s，%)

與 A549細(xì)胞比較，aP＜0．05aP ＜0．05 compared with A549 cell

分組Group A549 pEGFR-EGFP-A549西妥昔單抗Cetuximab 16．11 ± 1．83 17．68 ±0．92 NKTm 細(xì)胞 NKTm cell 21．71 ±2．95 20．64 ±5．21西妥昔單抗+NKTm細(xì)胞Cetuximab+NKTm cell 41．76 ± 3．45 52．74 ±6．30a

討 論

一項(xiàng)Ⅲ期臨床研究結(jié)果表明西妥昔單抗聯(lián)合化療一線治療晚期非小細(xì)胞肺癌可以顯著延長(zhǎng)患者的中位生存期 (11．3個(gè)月比10．1個(gè)月) 與1年生存率 (47%比42%)［3］。FLEX試驗(yàn)是第1個(gè)證明EGFR抑制劑靶向藥物與化療聯(lián)用可以延長(zhǎng)生存的臨床研究。然而，與結(jié)直腸癌治療中研究結(jié)果不同的是，西妥昔單抗在非小細(xì)胞肺癌的治療中缺乏有效的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，研究表明K-ras基因突變、EGFR基因突變、EGFR基因擴(kuò)增、與細(xì)胞骨架蛋白同源的第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶基因表達(dá)情況均與西妥昔單抗治療非小細(xì)胞肺癌的療效無(wú)關(guān)［7-8］。直到第14屆世界肺癌大會(huì)，Pirker等［4］報(bào)道一項(xiàng)新的數(shù)據(jù)分析顯示，EGFR免疫組織化學(xué)評(píng)分為高表達(dá)組，聯(lián)合西妥昔單抗治療的有效率及生存期顯著高于單純化療，因此認(rèn)為EGFR表達(dá)水平對(duì)西妥昔單抗聯(lián)合化療的生存期可能有預(yù)測(cè)作用，但尚缺乏前瞻性的研究加以證實(shí)。

西妥昔單抗除了可以與EGFR特異結(jié)合并阻斷下游信號(hào)的傳導(dǎo)外，還可以激活A(yù)DCC作用［1］，然而西妥昔單抗激活A(yù)DCC作用首先與腫瘤細(xì)胞表面EGFR結(jié)合，因此EGFR表達(dá)水平可能影響西妥昔單抗誘導(dǎo)的ADCC效應(yīng)從而影響其對(duì)非小細(xì)胞肺癌的療效。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，本研究選擇A549細(xì)胞作為靶細(xì)胞，進(jìn)行西妥昔單抗誘導(dǎo)ADCC作用殺傷非小細(xì)胞肺癌的體外研究。首先將A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFR基因，使轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞高表達(dá)EGFR分子，之后檢測(cè)西妥昔單抗介導(dǎo)ADCC作用以及單獨(dú)西妥昔單抗對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的抑制率。研究中效應(yīng)細(xì)胞NKTm細(xì)胞是以CD3+、CD8+、CD56+和CD16+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞，已在臨床中廣泛用于過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療［9］。本研究顯示西妥昔單抗介導(dǎo)的ADCC作用對(duì)高表達(dá)EGFR的A549細(xì)胞的抑制率顯著高于EGFR低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而西妥昔單抗單獨(dú)作用于兩組的抑制率差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，西妥昔單抗可能通過(guò)介導(dǎo)ADCC作用而對(duì)EGFR高表達(dá)的患者具有更好的療效。但Kurai等［1］認(rèn)為肺癌細(xì)胞較低水平的EGFR表達(dá)已足夠產(chǎn)生西妥昔單抗介導(dǎo)的最大的ADCC活性，EGFR表達(dá)水平的進(jìn)一步增加，對(duì)ADCC活性無(wú)相應(yīng)的影響。分析結(jié)果不同的原因可能為Kurai等［1］采用具有EGFR表達(dá)差異的不同肺癌細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，而本研究采用的是具有EGFR表達(dá)差異的同一肺癌細(xì)胞系，這樣可避免因不同腫瘤細(xì)胞系間的其他潛在干擾因素而非EGFR蛋白表達(dá)水平對(duì)ADCC活性的影響。此外，效應(yīng)細(xì)胞的活性、效靶比的不同也影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，尚需要進(jìn)一步的研究以及臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究結(jié)果提示西妥昔單抗介導(dǎo)的ADCC作用對(duì)EGFR蛋白高表達(dá)的肺腺癌A549細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用，這提示可能正是因?yàn)槲魍孜魡慰菇閷?dǎo)的ADCC作用在非小細(xì)胞肺癌的治療中發(fā)揮重要作用，因此高表達(dá)EGFR的腫瘤患者在接受西妥昔單抗聯(lián)合化療治療后能夠獲得更好的療效。本研究從細(xì)胞水平證實(shí)了Pirker等［4］的研究結(jié)果。因此，在西妥昔單抗的臨床應(yīng)用中或許應(yīng)該增加對(duì)患者免疫狀態(tài)的關(guān)注，如果能夠提高患者的細(xì)胞免疫功能可能會(huì)達(dá)到更好的療效，此外患者的免疫狀態(tài)的相關(guān)指標(biāo)是否可以作為西妥昔單抗療效預(yù)測(cè)因子也可以進(jìn)一步探討。

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Role of Epidermal Growth Factor Receptor Expression Level in Cetuximab Cytotoxicity and Antibody-dependent Cell-mediated Cytotoxicity Effect Against A549 Lung Cancer Cell Line

LI Jin-yu，JIAO Shun-chang，ZHANG Guo-qing，SUN Sheng-jie

Department of Medical Oncology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

JIAO Shun-chang Tel：13811331264，E-mail：lijinyu301@sina．com

ObjectiveTo investigate the role of epidermal growth factor receptor(EGFR)expression level in cetuximab cytotoxicity and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)effect against A549 lung cancer cell line．MethodsA549 cell line and NKTm cells were used as the target cell and the effector cell，respectively．pEGFR-EGFP plasmids were transfected into A549 cells by nucleofector method．EGFR expression levels were measured by immunohistochemistry．The ADCC activity induced by cetuximab was assessed by cell counting kit-8 assay．ResultsA549 cells transfected with pEGFR-EGFP plasmids expressed higher level of EGFR protein on membrane and were more sensitive to ADCC activity mediated by cetuximab(P ＜0．05) ．The inhibition rate of A549 cells showed no significant difference between transfection group and wild-type group when treated with cetuximab alone(P＞ 0．05) ．Conclusion EGFR expression level influences the sensitivity of A549 lung cancer cell line to ADCC activity mediated by cetuximab but not to cetuximab alone．

book=47,ebook=53

cetuximab;non-small cell lung cancer;epidermal growth factor receptor

焦順昌 電話：13811331264，電子郵件：lijinyu301@sina．com

R735．5

A

1000-503X(2014)02-0164-04

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．02．009

2013-06-17)

·論 著·