劉紅升，趙曉東，蘇 琴，王 瓊，姚詠明

中國人民解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院 1急救部 2超聲科，北京 100048

炎癥因子對類胰島素樣生長因子1沉默表達人冠狀動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的影響

劉紅升1，趙曉東1，蘇 琴1，王 瓊2，姚詠明1

中國人民解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院1急救部2超聲科，北京 100048

目的研究炎癥因子對類胰島素樣生長因子1(IGF1)沉默表達的人冠狀動脈平滑肌細胞 (hCASMCs)增殖和凋亡的影響。方法應(yīng)用慢病毒RNA干擾技術(shù)沉默hCASMCs的IGF1表達。分別用未感染病毒載體的細胞和感染陰性對照病毒載體的hCASMCs作為空白對照和陰性對照。腫瘤壞死因子-α 50 ng/ml與白細胞介素-1β 40 ng/ml共同刺激細胞8 h。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞培養(yǎng)上清液中IGF1濃度，MTT法及流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖及凋亡。結(jié)果炎癥因子刺激后，IGF1沉默表達的hCASMCs上清液中IGF1的濃度顯著低于空白對照組和陰性對照組 ［(426．35±120．96)比(1 030．69 ±54．69) 和 (992．82 ±26．90)pg/ml，P=0．000］; 細胞的增殖活性顯著低于兩個對照組 (0．302 ± 0．011 比0．401 ±0．028 和0．393 ±0．017，F(xiàn)=37．628，P=0．000)，凋亡率顯著高于對照組 ［(10．57 ±0．99)%比 (0．19 ±0．13)%和 (1．31±0．30)%，P=0．001］。結(jié)論炎癥因子可能具有抑制IGF1敲減后的hCASMCs增殖和促進凋亡的作用。

類胰島素樣生長因子1;炎癥因子;人冠狀動脈平滑肌細胞;RNA干擾;增殖;凋亡

Acta Acad Med Sin，2014，36(2)：176-179

類胰島素樣生長因子1(insulin-like grown factor 1，IGF1)具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖、定向遷移、分化和凋亡的作用。機體中IGF1可通過旁分泌或自分泌方式發(fā)揮生物學功能［1］。Okura等［2］認為在動脈粥樣硬化斑塊進展期，巨噬細胞浸潤的內(nèi)膜的IGF1含量明顯少于斑塊的其他部位，表明IGF1水平低下伴巨噬細胞浸潤是晚期易損斑塊破裂的原因之一。本研究用IGF1慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染人冠狀動脈平滑肌細胞 (human coronary artery smooth muscle cells，hCASMCs)，沉默hCASMCs的IGF1表達［3-4］，模擬易損斑塊血管平滑肌細胞自分泌IGF1減少的情況，用致炎癥前細胞因子腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 和白細胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β) 共同刺激hCASMCs，探討炎癥因子對IGF1沉默表達的hCASMCs增殖及凋亡的影響。

材料和方法

hCASMCs培養(yǎng)及分組hCASMCs(Casecade生物制劑公司，俄勒岡州，美國)在加入培養(yǎng)液添加劑的231完全培養(yǎng)液 (Casecade生物制劑公司)中，于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用第4代細胞實驗。我課題組采用慢病毒RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了IGF1慢病毒表達載體，該載體能顯著敲減hCASMCs的IGF1基因表達，敲減效率大于70%［3］。

將hCASMCs分為3組：未感染病毒載體的細胞組(空白對照)，陰性對照病毒載體PSC-NC-pGCSIL-GFP感染的細胞組 (陰性對照)，IGF1慢病毒表達載體感染的細胞組;每組3個復(fù)孔。慢病毒載體系統(tǒng)購自上海吉凱公司。3組的病毒感染滴度分別為0、(1．5×107)、 (1．4 ×107)TU/ml。TNF-α 50 ng/ml與 IL-1β 40 ng/ml共同刺激各組細胞8 h后，研究炎癥因子刺激對各組細胞表達IGF1、細胞增殖和調(diào)亡的影響。

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IGF1的表達IGF1為分泌型蛋白，采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞培養(yǎng)上清液IGF1的濃度［3-4］。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購自RayBiotech公司 (佐治亞州，美國)。

MTT法檢測細胞增殖收集對數(shù)生長期的細胞，取細胞懸液200 μl以1×105/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。每孔加入0．01 mmol/L MTT(Sigma公司，加利福尼亞州，美國)20 μl，孵育4 h。棄上清，加入二甲基亞砜150 μl，室溫下振蕩5 min，Bio-Rad酶標儀 (Beckman Coulter公司，加利福尼亞州，美國)測定570 nm處吸光值。

流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞經(jīng)冷PBS洗滌2次后，用-20℃預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。120×g離心4 min，棄上清，PBS洗滌3次，加100 μl PBS重懸，加40 μl含10 mg/ml Rnase的碘化丙啶染液 (Sigma公司)，4℃避光染色0．5 h，流式細胞儀 (BeckmanCoulter公司 加利福尼亞州，美國)測定熒光強度，采用CellQuest分析軟件進行細胞周期DNA含量分析，確定細胞周期分布。流式細胞儀在激發(fā)波長為488 nm，每次計數(shù)5 000個細胞。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩樣本均數(shù)的比較采用Student’s t檢驗，3組間均數(shù)差異的比較采用隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

炎癥因子降低IGF1沉默表達的hCASMCs表達IGF1酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果顯示，未用炎癥因子刺激的空白對照組、陰性對照組和IGF1慢病毒表達載體感染的細胞組細胞培養(yǎng)上清液中IGF1的濃度分別為(1 137．99 ± 44．17)、(1 096．30 ± 94．20) 和 (753．30 ±152．06)pg/ml，IGF1慢病毒表達載體感染細胞組細胞培養(yǎng)上清液中IGF1的濃度顯著低于另外兩組 (P=0．008)。炎癥因子刺激的3組細胞上清液中IGF1的濃度分別為 (1 030．69 ±54．69)、 (992．82 ±26．90) 和(426．35 ±120．96)pg/ml，IGF1 慢病毒表達載體感染細胞組細胞培養(yǎng)上清液中IGF1的濃度顯著低于另外兩組 (P=0．000)。炎癥因子刺激后兩個對照組細胞上清液中IGF1的濃度較炎癥因子刺激前有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0．05);而IGF1慢病毒表達載體感染細胞的上清液中IGF1的濃度較炎癥因子刺激前顯著降低 (P=0．001)。

炎癥因子抑制IGF1沉默表達的hCASMCs增殖析因設(shè)計的方差分析顯示，對未經(jīng)炎癥因子刺激的hCASMCs，干擾 RNA轉(zhuǎn)染細胞的活力為 0．341±0．020，顯著低于空白對照組 (0．417 ±0．035) 和陰性對照組 (0．401 ±0．019)(F=12．077，P=0．001);兩個對照組的細胞活力相近。炎癥因子刺激后，干擾RNA轉(zhuǎn)染細胞的活力為0．302±0．011，顯著低于空白對照組 (0．401 ±0．028) 和陰性對照組 (0．393 ±0．017)(F=37．628，P=0．000); 兩個對照組的細胞活力相近。兩個對照組炎癥因子刺激均未顯著降低細胞的活力 (P＞0．05)。在炎癥因子刺激下，IGF1慢病毒表達載體感染細胞的活力顯著降低 (P=0．000)。

炎癥因子促進IGF1沉默表達的hCASMCs凋亡不論經(jīng)炎癥因子刺激與否，IGF1沉默表達的hCASMCs的凋亡率均顯著高于兩個對照組 (P=0．000)。兩個對照組炎癥因子刺激均未顯著促進細胞凋亡 (P＞0．05)。在炎癥因子刺激下，IGF1沉默表達的hCASMCs的凋亡率顯著增加 (P=0．001)(表1)。

討 論

目前，尚不能確定IGF1是抑制急性冠脈綜合征斑塊形成的保護因子，還是斑塊進展的促進因子［5-7］。本研究在沉默hCASMCs中IGF1表達的基礎(chǔ)上，模擬易損斑塊血管平滑肌IGF1表達減少的情況，用致炎癥前細胞因子TNF-α和IL-1β共同刺激hCASMCs，探討炎癥因子對IGF1沉默表達的hCASMCs增殖及凋亡的影響。研究表明血管平滑肌細胞中存在抗凋亡機制，TNF-α單獨刺激不能使血管平滑肌細胞凋亡［8-9］，在易損斑塊中血管平滑肌細胞同時受到兩種以上的致炎癥前細胞因子刺激，因此本研究選取TNF-α和IL-1β共同刺激hCASMCs。結(jié)果顯示TNF-α+IL-1β對空白對照組hCASMCs上清液中IGF1的濃度有下調(diào)作用，但與非炎癥因子處理組比較差異無統(tǒng)計學意義。由于酶聯(lián)免疫吸附試驗方法測定的是細胞培養(yǎng)上清中IGF1的濃度，而不僅是hCASMCs IGF1的表達量;此外，IGF1慢病毒表達載體感染細胞的上清液中IGF1的濃度較炎癥因子刺激前顯著降低，由此筆者推測當hCASMCs自分泌或旁分泌IGF1減少時，TNF-α+IL-1β能進一步下調(diào)hCASMCs表達IGF1，具體機制需要進一步研究。

當TNF-α+IL-1β刺激hCASMCs時，IGF1慢病毒表達載體感染細胞的增殖活力顯著低于兩個對照組，凋亡率顯著高于其他兩組;表明在IGF1自分泌或旁分泌減少時，炎癥因子促進血管平滑肌細胞增殖的作用被減弱，此外，局部的炎性刺激將促進hCASMCs凋亡。Shai等［10］研究顯示過度表達 IGF1基因能提高ApoE基因-/-小鼠粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。這可能是易損斑塊內(nèi)炎癥細胞釋放的致炎癥因子對斑塊內(nèi)血管平滑肌細胞損害加重的原因之一。這一結(jié)尚需進一步證實。

表1 各組hCASMCs的細胞周期與凋亡的比較 (n=3，±s，%)Table 1 Comparison of cell cycle and apoptosis in hCASMCs in different groups(n=3，x－±s，%)

表1 各組hCASMCs的細胞周期與凋亡的比較 (n=3，±s，%)Table 1 Comparison of cell cycle and apoptosis in hCASMCs in different groups(n=3，x－±s，%)

hCASMCs：人冠狀動脈平滑肌細胞;Con：空白對照組;NC：陰性對照組;RNAi：類胰島素樣生長因子1慢病毒表達載體感染細胞組;CV：變異系數(shù); 與 RNAi組比較，aP＜0．01; 與未刺激組比較，bP＜0．01hCASMCs：human coronary artery smooth muscle cells;Con：blank control;NC：negative control;RNAi：hCASMCs transfected with lentiviral vector carrying insulin-like grown factor gene 1;CV：coefficient of variance;aP ＜ 0．01 compared with RNAi group;bP ＜ 0．01 compared with insulin-like grown factor gene 1-slienced hCASMCs without simulation of inflammatory factors

Cell cycle 凋亡分組Group 細胞周期Apoptosis Con 未刺激 Without simulation 42．27 ±1．21 23．21 ±1．08 34．84 ±0．72 9．20 ±0．52 0．09 ±0．02a刺激 Simulation with inflammatory factors 46．86 ±0．47 23．31 ±1．55 28．17 ±4．20 10．68 ±0．56 0．19 ±0．13 G0+G1 G2+M S CV a NC 未刺激 Without simulation 44．92 ±0．90 28．78 ±0．96 25．81 ±0．35 9．67 ±0．98 0．18 ±0．07a刺激 Simulation with inflammatory factors 39．49 ±0．87 33．36 ±1．52 26．81 ±0．96 9．32 ±2．04 1．31 ±0．30a RNAi 未刺激 Without simulation 41．49 ±0．61 21．96 ±0．62 28．97 ±2．55 11．92 ±0．38 7．66 ±0．89刺激 Simulation with inflammatory factors 38．79 ±1．01 23．89 ±1．55 27．68 ±3．60 12．37 ±0．45 10．57 ±0．99b

綜上，炎癥因子可能具有抑制IGF1敲減后的hCASMCs增殖和促進凋亡的作用。

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Effect of Inflammatory Factors on Cell Proliferation and Apoptosis in Insulin-like Grown Factor 1-slienced Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells

LIU Hong-sheng1，ZHAO Xiao-dong1，SU Qin1，WANG Qiong2，YAO Yong-ming1

1Deparment of Emergency，2Deparment of Ultrasound，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100048，China

ZHAO Xiao-dong Tel：010-66867371，E-mail：zxd63715@126．com

ObjectiveTo study the effect of inflammatory factors on cell proliferation and apoptosis in insulin-like grown factor 1(IGF1)-slienced human coronary artery smooth muscle cells(hCASMCs)．MethodsWe silenced the expression of IGF1 in hCASMCs using the lentivirus-mediated RNA interference technology．Blank control group and negative control group were set using the hCASMCs without the infection of a virus vector and the hCASMCs with the infection of a negative control virus vector，respectively．After the treatment of these cells with both tumor necrosis factor-α 50 ng/ml and interleukin-1β 40 ng/ml，the concentration of IGF1 in cell-culture medium was detected by enzyme-linked immunosorbent assay，and the proliferation and apoptosis were evaluated by MTT assay and flow cytometry．ResultsAfter the simulation with inflammatory factors，the concentration of IGF1 in the supernatant fluid of cultured IGF1-slienced hCASMCs was significantly lower than those in the blank control group and negative control group ［(426．35 ±120．96)vs．(1 030．69 ±54．69)and(992．82 ± 26．90)pg/ml，P=0．000) ．The proliferation of IGF1-slienced hCASMCs was substantially much less than the two control groups(0．302 ± 0．011 vs．0．401 ± 0．028 and 0．302 ± 0．011，F(xiàn)=37．628，P=0．000)，and the apoptosis rate of IGF1-slienced hCASMCs was significant increased compared with the other two groups ［(10．57 ±0．99)%vs．(0．19 ±0．13)%and(1．31 ±0．30)% ，P=0．001］ ．Conclusion Inflammatory factors can inhibit the cell proliferation and promote apoptosis after the knock-down of IGF1 in hCASMCs．

insulin-like grown factor 1;inflammation factors;human coronary artery smooth muscle cells;RNA interference;proliferation;apoptosis

趙曉東 電話：010-66867371，電子郵件：zxd63715@126．com

R392．12

A

1000-503X(2014)02-0176-04

10．3881/j．issn．1000-503X．2014．02．011

國家杰出青年科學基金 (30125020)Supported by the National Sciences Foundation for Outstanding Youth of China(30125020)

2013-09-26)

·論 著·