羅湘玉，羅衛(wèi)民，鄭雪松

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

穿心蓮內(nèi)酯對肺癌細胞MMP-9表達的影響及分子機制研究

羅湘玉，羅衛(wèi)民Δ，鄭雪松

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 胸心外科，湖北 十堰 442000）

目的觀察穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide， AD）對肺癌細胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表達的影響及其分子機制。方法體外培養(yǎng)肺癌細胞系H3255，分別用1．0，3．0和5．0 μmol/L AD處理細胞24 h，未處理組為空白對照。傷口愈合實驗和侵襲實驗分別檢測AD對H3255細胞遷移與侵襲的影響。RT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達；Western blot檢測MMP-9蛋白表達和Akt磷酸化。熒光素酶報告基因分析NF-κB和MMP-9的活性。結(jié)果傷口愈合實驗和Transwell小室實驗結(jié)果顯示，AD能在不影響細胞活性的條件下顯著抑制H3255細胞侵襲和遷移。同時，Western blot和RT-PCR結(jié)果證實AD能抑制MMP-9蛋白及mRNA表達。此外，AD能抑制Akt磷酸化以及NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。PI3 K抑制劑LY 294002處理后，NF-κB-luc活性以及MMP-9蛋白表達顯著降低。此外，不同濃度AD處理能顯著抑制MMP-9的啟動子活性。結(jié)論AD是一種潛在的抗肺癌細胞轉(zhuǎn)移藥物，它可能通過影響PI3 K/NF-κB通路抑制MMP-9表達而發(fā)揮作用。

穿心蓮內(nèi)酯；肺癌細胞；基質(zhì)金屬蛋白酶9

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 AD購自Sigma-Aldrich公司（純度≥95%），并用二甲基亞砜溶解。細胞培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品，培養(yǎng)板和Transwell小室購自Corning。Trizol試劑購自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物。抗MMP-9和β-actin抗體購自Santa Cruz。磷酸化Akt，總Akt抗體購自Cell Signaling。ECl化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Amersham Pharmacia。NF-κB熒光素酶報告基因購自SABioscicence，雙重?zé)晒馑孛笇嶒炏到y(tǒng)購自Promega。pGL 3-basic載體和DNA轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen。主要實驗儀器：光測定儀(Luminometer 20/20 n，Turner BioSystems），酶標儀（iMark，BIO-RAD），PCR 儀（Veriti，Applied Biosystems），倒置顯微鏡（TS-2000，Nicon）。

1.2 細胞培養(yǎng) H3255細胞株購自購自ATCC，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。分別設(shè)立對照組（加入等體積的DMSO）及不同濃度AD處理組（分別加入終濃度為1.0，3.0，5.0 μmol/L的AD作用24 h）。采用MTT觀察AD對H3255細胞的增殖情況，即H3255孵育結(jié)束后，每孔加入30 μL MTT溶液（1 mg/mL）孵育2 h。棄上清，并加入200 μL DMSO，充分混勻，用酶標儀測定各孔的吸光度值（OD 570），并計算抑制率。抑制率=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。

1.3 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA表達 采用Trizol提取RNA，并根據(jù)試劑盒提供的步驟進行RTPCR。PCR反應(yīng)條件如下：94℃變性 30 s，65℃（MMP-9）或 59℃（GAPDH）30 s，72℃延伸 30 s。隨后進入 40（MMP-9）或35（GAPHD）個擴增循環(huán)。其中MMP-9引物分別為5’-CGCTACCACCTCGAACTTTG-3’和 5’-GCCATTCAC GTCGTCCTTAT-3’，產(chǎn)物 196 bp。GAPDH：5’-TCACCAT CTTCCAGGAGCGA-3’，5’-CACAATGCCGAAGT GGTCGT-3’，產(chǎn)物700 bp。擴增產(chǎn)物隨后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，并采用Image J軟件進行灰度分析并計算2者比值。

1.4 傷口愈合實驗 通過傷口愈合實驗測定細胞的遷移能力。將5×106細胞接種于6孔板中37℃培養(yǎng)6 h。待細胞呈單層貼壁生長后，用200 μL的移液管尖端在板上劃痕。PBS洗滌后加入含有AD的完全培養(yǎng)基孵育24 h。在顯微鏡下拍照并計算遷移率：（1-處理后劃痕距離/對照組劃痕距離）×100%。

1.5 侵襲性實驗 將基質(zhì)膠均勻鋪至Transwell小室上室，并加入100 μL細胞懸液（106/mL），下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，37℃孵育24 h。取出Transwell，多聚甲醛固定，風(fēng)干后加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min。擦除上室細胞，顯微鏡下隨機選擇視野拍照，計算遷移到下腔表面的細胞數(shù)。其中侵襲抑制率=（1-樣本穿膜細胞數(shù)/對照組穿膜細胞數(shù)）×100%。

1.6 Western blot 根據(jù)試劑盒提供的步驟提細胞總蛋白并測定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（Millipore），并利用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入抗MMP-9或抗Akt抗體4℃孵育過夜。多次洗滌之后，加入HRP標記的抗體孵育1 h。ECL法（Amersham）發(fā)光、顯影。

1.7 瞬時轉(zhuǎn)染和熒光素酶報告基因分析 從Genebank獲取MMP-9基因啟動子序列（上游720 bp～11 bp），采用PCR方法將其克隆至pGL 3-basic載體上，構(gòu)建pGL 3-MMP-9-luc報告基因質(zhì)粒。生長于6孔板中的6 H 3255細胞隨后共轉(zhuǎn)入0.2 μg pGL 3-MMP-9-luc（或NF-κB-luc）質(zhì)粒，以及0.2 μg pSV-β-半乳糖苷酶質(zhì)粒。隨后細胞加入不同濃度AD作用24 h。采用雙重?zé)晒馑孛笀蟾嫦到y(tǒng)（Promega）計算螢光素酶活性的相對值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，并采用單因素方差分析方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD抑制H3255細胞的遷移和侵襲 為了觀察AD對H 3255侵襲和遷移的影響，首先應(yīng)確定AD的最大作用濃度。MTT結(jié)果顯示，1.0～5.0μmol/L AD處理對細胞的活性無明顯影響（結(jié)果未顯示）。傷口愈合實驗顯示：1.0，3.0，5.0μmol/L AD處理H3255細胞后，細胞遷移率分為為（67.07±4.27）%，（49.82±3.71）%和（37.08±2.74）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Transwell結(jié)果顯示，不同濃度的AD也能呈劑量依賴性方式抑制H3255細胞侵襲（見表1）。

2.2 AD抑制H3255細胞MMP-9蛋白及mRNA表達RT-PCR結(jié)果顯示，H3255細胞未處理前，MMP-9 mRNA表達水平較高，經(jīng)不同濃度AD處理后，其mRNA水平隨著濃度的增高而降低（見圖 1 A）。Western blot結(jié)果也顯示，1.0～5.0 μmol/L AD處理后，MMP-9蛋白含量逐漸降低（見圖1 B）。

圖1 AD對MMP-9 mRNA（A）與蛋白（B）表達的影響1. 對照組；2. 1.0μmol/L AD組；3. 3.0μmol/L AD組；4. 5.0μmol/L AD組Fig.2 Effect of AD on the mRNA expression (A) andprotein expression (B) of MMP-91. Control；2. 1.0μmol/L AD group；3. 3.0μmol/L AD group；4. 5.0μmol/L AD group

2.3 AD抑制PI3 K/NF-κB通路的活性 Western blot結(jié)果顯示，AD處理后，H 3255細胞中磷酸化Akt水平明顯降低，而總Akt無明顯影響（見圖2A）。此外，報告基因結(jié)果顯示，AD也能影響NF-κB-luc的轉(zhuǎn)錄活性，同時，采用20 μmol/L PI3 K抑制劑LY 294002處理后，NF-κB-luc活性顯著降低（見圖2B）。

圖2 AD對H3255細胞PI3K磷酸化（A）及NF-κB活性（B）的影響1. 對照組；2. 1.0μmol/L AD組；3. 3.0μmol/L AD組；4. 5.0μmol/L AD組； 5. 20μmol/L LY294002*P＜0.05，與對照組相比Fig.2 Effect of AD on PI3K phosphorylation (A) and NF-κB activity (B) in H3255 cells1. Control；2. 1.0μmol/L AD group；3. 3.0μmol/L AD group；4. 5.0μmol/L AD group；5. 20μmol/L LY294002*P＜0.05，compared with control group

2.4 AD經(jīng)PI3 K/NF-κB抑制MMP-9的表達與轉(zhuǎn)錄 Western blot顯示，PI3 K抑制劑LY 294002和NF-κB抑制劑PDTC處理H3255細胞后，MMP-9表達顯著降低（見圖3A）。此外，報告基因顯示，不同濃度AD處理能顯著抑制MMP-9的啟動子活性，從而抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄（見圖3B）。

圖3A PI3K和NF-κB抑制劑對MMP-9蛋白表達的影響1. 陰性對照；2. 20μmol/L LY294002；3. 20 μmol/L PDTCFig.3A Effect of PI3K and NF-κB inbitors on MMP-9 protein expression1. Control；2. 20μmol/L LY294002；3. 20μmol/L PDTC

圖3B AD對MMP-9轉(zhuǎn)錄活性的影響1. 對照組；2. 1.0μmol/L AD；3. 3.0μmol/L AD；4. 5.0μmol/L AD；*P＜0.05，與對照組相比Fig.3B Effect of AD on MMP-9 transcriptional activity1. Control； 2. 1.0μmol/L AD；3. 3.0μmol/L AD；4. 5.0μmol/L AD*P＜0.05，compared with control

3 討論

對于肺癌而言，癌細胞的局部侵潤以及遠處轉(zhuǎn)移是患者治療失敗和死亡的首要原因。癌細胞在侵潤性生長過程中，ECM的降解是癌細胞從原發(fā)部位脫落，并經(jīng)淋巴結(jié)或血液轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[8]。而MMP-9在其中發(fā)揮至關(guān)重要作用[9]。因此，預(yù)防或抑制癌細胞侵潤和轉(zhuǎn)移在很大程度上可提高癌癥患者的生存率。有研究顯示：AD能抑制多種腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10-11]；然而，AD對肺癌的抑制作用尚未完全清楚。本研究證實AD在無細胞毒性的濃度范圍內(nèi)能明顯抑制H 3255細胞的侵潤和轉(zhuǎn)移，并能明顯抑制明膠酶活性和MMP-9的表達，這表明AD在肺癌中通過抑制MMP-9的表達和活性而具有抗侵襲的潛能。

PI3 K是一種脂質(zhì)激酶，通過激活A(yù)kt（蛋白激酶B）控制多種生理過程，它通過誘導(dǎo)P 21 WAF1定位于細胞質(zhì)，并通過滅活前凋亡因子BAD和caspase-9發(fā)揮抗凋亡作用；此外，活化的Akt可通過誘導(dǎo)MMPs的表達而促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。研究顯示，MMP-9 mRNA含量與PI3 K的活性成正相關(guān)[13]。本研究也證實，AD能抑制PI3 K產(chǎn)物Akt磷酸化，從而抑制MMP-9的表達。NF-κB是Akt下游通路的重要靶分子。并參與調(diào)控MMP-9的表達，并與炎癥、腫瘤細胞增殖、侵潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。此外，NF-κB在多種腫瘤細胞中持續(xù)激活，并誘導(dǎo)多種抗凋亡蛋白表達而導(dǎo)致化療/放療耐受[15]。因此抑制NF-κB的活性可能有利于提高藥物的療效。本研究結(jié)果顯示，AD可有效抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。由于MMP-9的啟動子區(qū)域存在NF-κB的結(jié)合位點[16]，因此本研究構(gòu)建了MMP-9啟動子序列的報告基因，結(jié)果也證實，AD可通過影響PI3 K/NF-κB的活性，從而抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄激活作用。

綜上所述，本研究通過體外實驗證明AD具有抑制H3255細胞侵潤的能力。其機制可能通過抑制PI3 K/ NF-κB信號通路，最終下調(diào)MMP-9的活性及表達有關(guān)。這表明AD可能是一種富有前途的抗癌輔助藥物。盡管如此，但其在體內(nèi)的分布以及轉(zhuǎn)運仍不清楚，此外，不同的腫瘤細胞，對AD的敏感性也可能有所不同。在隨后的研究中，我們將通過動物實驗對其安全性和代謝動力學(xué)等方面開展更進一步研究。

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Effect of andrographolide on MMP-9 expression in lung cancer cell and its molecular mechanism

LUO Xiang-yu, LUO Wei-minΔ, ZENG Xue-song

(Department of Cardiothoracic Surgery，Hubei University of Medicine Affiliated Taihe Hospital of Shiyan, Shiyan 442000, China)

ObjectiveTo investigate the effect and molecular mechanism of Andrographolide (AD) on matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)expression in human colon cancer H3255 cells.MethodsHuman lung cancer H3255 cell line weve cultured in vitro, and treated with 1.0, 3.0, 5.0 μmol/L AD for 24 h, untreated cells were used as blank control. Cell viability, cell migration and cell invasion were analyzed by MTT assay, scratch healing assay and transwell membrane assay, respectably. Expression of MMP-9 mRNA was analyzed by RT-PCR. Protein expression and phosphorylation of Akt were detected by Western blot. Activity of NF-κB and MMP-9 were analyzed by luciferase reporter assay.ResultsAD could significantly reduced H 3255 cells invasion and migration without affecting the viability of cells, as demonstrated by scratch healing and transwell membrane assay. Furthermore,Western blot and RT-PCR results showed that AD could markedly inhibited MMP-9 activity and its expression in both protein and mRNA levels. AD could attenuated Akt’s phosphorylation and the activity of NF-κB. Moreover, LY 294002, an inhibitor of PI3 K, could significantly inhibited NF-κB transcriptional activity and MMP-9 expression. In addition, different concentrations of AD could inhibit the promote activity of MMP-9.ConclusionAD was a potential anti-invasive agent by inhibiting MMP-9 involved in PI3 K/NF-κB pathways.

Andrographolide; human lung cancer cells; matrix metalloproteinase-9

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0013-04

肺癌是各類癌癥死亡的首位。尤其是非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）最常見（占肺癌總數(shù)的 80%以上）[1]。肺癌起病隱匿，90%以上患者死于癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。在此過程中，腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落，并降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的最重要病理生理改變，而此過程與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的活性密切相關(guān)[3-4]。因此，以MMPs為研究靶點，探索抑制MMPs活性的治療藥物，對肺癌的治療具有重要意義。

穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide，AD）是我國傳統(tǒng)中草藥穿心蓮中提取出來的一類二萜類化合物。它通常作為一種消炎解毒藥物用于治療各種感染性疾病[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AD除了傳統(tǒng)的抗病毒作用外，也具有抗腫瘤的潛能[6-7]。盡管如此，但AD能否影響肺癌細胞的遷移與侵襲目前仍不清楚。本研究旨在觀察AD對肺癌H3255細胞的遷移與侵襲有何影響，并探討其可能的調(diào)控機制。

國家自然科學(xué)基金（81372984）

羅湘玉，女，副主任護師，研究方向：心肺疾病的防治研究，E-mail：xiangyu_luo@126.com；羅衛(wèi)民，通信作者，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：胸心外科疾病的診斷與治療，E-mail: weiminluo@163.com。