邱樑 李晟 姚琪 蘇郁達(dá)

[摘要] 目的 探討在高脂血癥大鼠模型中應(yīng)用纈沙坦進(jìn)行干預(yù)治療對血脂的影響，并分析其抗炎分子機(jī)制。 方法 選取30只健康雄性Wistar大鼠，利用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分別設(shè)為A組、B組和C組，每組各10只。A組為對照組，給予常規(guī)飲食；B組和C組均為高脂血癥模型組，兩組均進(jìn)食高脂飼料達(dá)8周，其中C組在第9周開始進(jìn)行纈沙坦14 mg/（kg·d）藥物灌腸處理，而B組則采取生理鹽水灌腸。待喂養(yǎng)第8周末，采取三組大鼠內(nèi)眥靜脈血，檢測其血脂水平和超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）。待第18周末（纈沙坦干預(yù)治療10周后），利用2%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉后，采取三組大鼠心室內(nèi)血液，檢測血脂水平、血清炎癥因子；并留取主動脈全長用于提取RNA，一部分用于HE染色觀察動脈內(nèi)膜的改變。 結(jié)果 第8周末，B、C兩組總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）[B組：（10.18±2.06）、（1.71±0.25 ）mmol/L；C組：（9.32±2.22）、（1.74±0.39）mmol/L]明顯高于A組[（2.07±0.43）、（1.12±0.26）mmol/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；第18周末，B、C兩組的TC值[11.10±2.54）、（10.02±1.99）mmol/L]明顯高于A組[（2.58±0.22）mmol/L]， B組血清炎癥因子hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8[（166.11±21.09）mg/L、（1.55±0.18）μg/L、（166.85±54.37）ng/L、（410.22±29.27）ng/L]明顯高于A組[（85.31±28.51）mg/L、（0.84±0.25）μg/L、（90.07±30.34）ng/L、（270.82±20.11）ng/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。經(jīng)纈沙坦干預(yù)治療10周后，C組血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6[（98.25±12.77）mg/L、（1.18±0.30）μg/L、（92.26±29.37）ng/L]均低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05），纈沙坦干預(yù)治療18周后，B組hs-CRP mRNA、TNF-α mRNA和IL-6 mRNA[（2.76±0.40）、（3.21±0.46）、（2.33±0.35）]明顯高于A組[（1.00±0.04）、（1.01±0.03）、（1.02±0.03）]和C組[（2.76±0.40）、（3.21±0.46）、（2.33±0.35）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 纈沙坦能夠降低高脂血癥大鼠模型的血脂水平，抑制促炎因子釋放，在抗動脈粥樣硬化方面發(fā)揮出可觀的效果。

[關(guān)鍵詞] 高脂大鼠；纈沙坦；血脂；炎癥因子；效果

[中圖分類號] R543.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）06（a）-0020-04

Analysis of the influence of Valsartan on the lipid level and its molecular mechanism of anti-inflammation in model rats with high fat

QIU Liang1 LI Sheng2 YAO Qi1 SU Yuda3

1.Department of Cardiology， the People's Hospital of Shengzhou， Zhejiang Province， Shengzhou 312400， China； 2.Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China； 3.Department of Neurology， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Zhejiang Province， Hangzhou 310009， China

[Abstract] Objective To explore the intervention effect on blood lipid of valsartan for the rat model with hyperlipidemia， and to explore the anti-inflammatory molecular mechanism. Methods 30 healthy male Wistar rats were selected by random number table method and they were divided into group A， B and C， 10 rats in each group. Group A was given routine diet as the control group， group B and C were fed with high fat diet for up to 8 weeks， as hyperlipidemia model group. Group C was treated with Valsartan enema 14 mg/kg per day at the 9 weeks， while group B was taken normal saline enema. At the end of 8 weeks after feed， the blood lipid level and high sensitive C reactive protein （hs-CRP） were detected by angular vein blood. At the end of 18 weeks after feed （Valsartan treatment after 10 weeks）. After intraperitoneal cavity anesthesia with 2% Pentobarbital Sodium， the lipid levels， serum inflammatory factors were detected by ventricular blood， and RNA was extracted by the aorta and part of them was used for HE staining to observe arterial intimal changes. Results At the end of 8 weeks， TC， LDL-C of group B and C [group B：（10.18±2.06）， （1.71±0.25） mmol/L； group C：（9.32±2.22）， （1.74±0.39） mmol/L] were higher than those of group A [（2.07±0.43）， （1.12±0.26） mmol/L]， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. At the end of 18 weeks， TC of group B and C [（11.10±2.54）， （10.02±1.99） mmol/L] were higher than that of group A [（2.58±0.22） mmol/L]， hs-CRP， TNF-α， IL-6， IL-8 of group B [（166.11±21.09）， （1.55±0.18）， （166.85±54.37）， （410.22±29.27） ng/L] were higher than those of group A [（85.31±28.51） mg/L， （0.84±0.25） μg/L， （90.07±30.34） ng/L， （270.82±20.11） ng/L]， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Treated with Valsartan after 10 weeks， hs-CRP， TNF-α， IL-6 of group C [（98.25±12.77） mg/L， （1.18±0.30） μg/L， （92.26±29.37） ng/L] were lower than those of group B （P < 0.05）. At end of 18 weeks， hs-CRP mRNA， TNF-α mRNA and IL-6 mRNA of group B [（2.76±0.40）， （3.21±0.46），（2.33±0.35）] were higher than group A [（1.00±0.04）， （1.01±0.03）， （1.02±0.03）] and group C [（2.76±0.40）， （3.21±0.46）， （2.33±0.35）]， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. hs-CRP mRNA， TNF-α mRNA， IL-6 mRNA were lower than those of group B （P < 0.05）. Conclusion Valsartan can reduce the blood lipid level of the model of hyperlipidemia rats， inhibit proinflammatory cytokine release， which plays a significant effect on anti atherosclerosi.

[Key words] High fat rats； Valsartan； Blood lipid； Inflammatory factor； Effect

隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加快，再伴隨人們生活水平的改善，在日常飲食結(jié)構(gòu)方面出現(xiàn)了極大的改變，其中高脂、高蛋白飲食逐漸占據(jù)了人們的飲食習(xí)慣[1]。而與此相伴行的是高脂血癥和動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生率逐年攀升，AS又在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，所以如何防止AS已經(jīng)引起全世界醫(yī)務(wù)人員的廣泛關(guān)注[2]。近年來，關(guān)于AS的基礎(chǔ)研究越來越多，其中有文獻(xiàn)指出，AS不是單純由血脂沉積于血管壁引發(fā)的病變，在該病的發(fā)病過程中，炎癥因子也發(fā)揮了不可忽視的作用[3]。所以，鑒于前人研究的基礎(chǔ)，對于AS，臨床上不僅需要降血脂治療，還需要抑制炎癥因子的釋放。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，纈沙坦在抗AS方面取得一定的成效[4]。本研究旨在探究纈沙坦在抗AS過程中對體內(nèi)分子水平的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

從浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買30只健康雄性Wistar大鼠（合格證編號：醫(yī)動字第220010004），體重95～125 g，年齡均為2個(gè)月，屬于清潔級動物。將所有大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采取其內(nèi)眥靜脈血檢測其血脂水平并測量體重，了解大鼠的一般生理狀況。利用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分別設(shè)為A組、B組和C組，每組各10只。三組大鼠在年齡、體重及血脂水平方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

A組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。B組和C組均建立高脂血癥模型組，兩組均采取高脂飼料喂養(yǎng)，喂食達(dá)8周，飼料的配比為2%膽固醇、10%豬油、0.2%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶和基礎(chǔ)飼料87.6%，進(jìn)食量為75 g/d每只。待第8周末時(shí)，大鼠斷尾取血，測定，以血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、 低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高，而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C） 降低，作為高脂血癥建模是否成功的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。作為高脂血癥建模是否成功的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。自喂食第9周始，B組和C組分別給予生理鹽水（北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字S10870001）灌腸處理和纈沙坦（北京諾華制藥廠生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20040217）14 mg/（kg·d）灌腸處理；兩組大鼠的灌腸時(shí)間均在每天下午4點(diǎn)進(jìn)行，由經(jīng)過培訓(xùn)的專門人員進(jìn)行灌腸操作。待第18周末，利用2%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉后，用5 mL的注射器穿刺三組大鼠心臟采集血液，并立即分離出血清，將標(biāo)本置于-80℃冰箱內(nèi)保存。并迅速打開胸腔，使用200℃干烤的器械于手術(shù)臺上取其主動脈全長（從主動脈弓起始到腹主動脈分支處），迅速將組織置于4℃ DEPC水中洗去血液后，置凍存管中并迅速投入液氮中，10 min后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆茫糜谔崛NA，一部分用于HE染色觀察動脈內(nèi)膜的改變。

1.2.1 血脂和血清超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）測定高脂飼料喂養(yǎng)8周后及10周干預(yù)治療后（第18周末），采用酶聯(lián)免疫分析法測定大鼠血脂和hs-CRP的水平。其中血脂包括TC、TG、LDL-C和HDL-C。

1.2.2 血清炎癥因子測定第18周末采用γ-放射免疫計(jì)數(shù)器檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）水平。

1.2.3 mRNA表達(dá)情況測定第18周末，用RT-PCR法測量三組大鼠主動脈中hs-CRP mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠在第8周末的血脂水平比較

在第8周末，B組和C組的TC、LDL-C均高于A組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.98、5.04、5.11、5.84，均P < 0.05），說明B組和C組經(jīng)過8周高脂飼料喂養(yǎng)后，成功建立高脂血癥模型。B組和C組之間的血脂水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明兩組作為高脂血癥模型具有可比性。見表1。

表1 三組大鼠在8周末的血脂水平比較（mmol/L，x±s）

注：與A組比較，*P < 0.05；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

2.2 三組大鼠在第18周末的血脂水平比較

在第18周末，B組和C組的TC值高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.63、5.74，均P < 0.05）。C組的TC、TG、LDL-C相較于B組均有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

表2 三組大鼠在第18周末的血脂水平比較（mmol/L，x±s）

注：與A組比較，*P < 0.05；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

2.3 三組大鼠在第18周末的血清炎癥因子水平

B組血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8水平均高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.76、5.81、6.11、5.46，均P < 0.05）；經(jīng)纈沙坦10周干預(yù)治療后，C組血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6水平均低于B組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.43、5.26、5.77，均P < 0.05）。見表3。

2.4 三組大鼠在第18周末mRNA表達(dá)情況

B組hs-CRP mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA均高于A組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.90、5.18、5.26，均P < 0.05）；C組在應(yīng)用纈沙坦干預(yù)治療10周末，其hs-CRP mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA均低于B組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.96、5.33、5.71，均P < 0.05）。見表4。

表4 三組大鼠在第18周末各炎性分子mRNA表達(dá)情況（x±s）

注：與A組比較，*P < 0.05；與B組比較，ΔP < 0.05；hs-CRP：超敏C反應(yīng)蛋白；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白介素6

3 討論

AS是一種常見的心血管系統(tǒng)疾病，該病是由于血脂在血管壁沉積和血管壁成分發(fā)生改變所致，好發(fā)于富含彈性纖維的肌性動脈和彈性動脈[5]。AS的病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為血管壁增厚變硬、管腔狹窄及彈性減弱。對于該病的病因?qū)W目前尚未完全明確，但現(xiàn)在較為認(rèn)可的觀點(diǎn)是“內(nèi)皮損傷纖維增生學(xué)說”[6]，由于脂質(zhì)蓄積于血管壁，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，暴露膠原纖維，進(jìn)而激發(fā)體內(nèi)炎性反應(yīng)，出現(xiàn)灶性纖維增生，病灶深部為壞死的脂質(zhì)池和粥樣物質(zhì)。在粥樣斑塊形成的過程中，與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、血小板及病灶內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表達(dá)、合成、釋放了大量炎癥介質(zhì)，如多種黏附分子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、溶酶體酶、蛋白水解酶、活性氧及其衍生物等，而參與炎性反應(yīng)[7-9]。

AS是由于血脂及炎癥兩者相互作用所引發(fā)的疾病，在本次研究中也充分說明，血脂水平和炎癥之間存在明顯的相關(guān)性。B組和C組均為高脂血癥建模組，兩組待高脂飼料喂食達(dá)8周后，其血液中TC和LDL-C水平明顯高于A組（正常飼料喂養(yǎng)組）。而與此同時(shí)，B組和C組炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平均高于A組。這也充分表明，炎癥因子在AS發(fā)病進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。

由于血液中的多種有害物質(zhì)（如脂蛋白、膽固醇增加等）長期刺激血管壁，導(dǎo)致血管壁因長期物理或化學(xué)性刺激出現(xiàn)慢性炎性變化[10]，進(jìn)而誘導(dǎo)體內(nèi)炎癥物質(zhì)（可溶性白細(xì)胞黏附分子和趨化因子）合成和分泌量增多，導(dǎo)致脂質(zhì)在血管壁的附著力度增強(qiáng)，引發(fā)AS早期病變的出現(xiàn)，在臨床中表現(xiàn)為脂紋[11]。在AS的炎癥發(fā)生環(huán)節(jié)過程中，有多種成分共同參與，其中包括直接參與炎性反應(yīng)細(xì)胞（如單核細(xì)胞）、間接參與炎性反應(yīng)細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞）和促炎因子[12]。目前，促炎因子是AS研究的熱點(diǎn)方向，而作為最富有代表性的hs-CRP是目前研究最多的分子之一[13]，該物質(zhì)具有炎癥直接促進(jìn)效應(yīng)，可激發(fā)體內(nèi)IL-6、IL-8及TNF-α等炎癥因子在體內(nèi)合成和分泌。IL-8具有極強(qiáng)的炎癥放大效應(yīng)，它可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的克隆能力并使其向血管內(nèi)膜處增殖，另外它還增強(qiáng)單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附力度，使AS的病變更加明顯[14]。AS與炎癥因子兩者之間的關(guān)系是相輔相成的，隨著體內(nèi)促炎因子的增加，會進(jìn)一步誘導(dǎo)平滑肌向內(nèi)膜下遷移、增生，還會出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化，使平滑肌源性泡沫細(xì)胞數(shù)目增多，加重AS。而AS的形成，又會加劇血管內(nèi)膜局部的免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞壞死、破壞。鑒于理清AS與血脂和炎癥之間的關(guān)系，可以為該病的臨床防治提供理論性依據(jù)[15]。本次研究的結(jié)果表明，應(yīng)用纈沙坦進(jìn)行干預(yù)，不僅可降低大鼠體內(nèi)血脂水平，還可以使炎癥因子得到不同程度的下降。

纈沙坦最早應(yīng)用于臨床是因其具有較強(qiáng)的降血壓作用，該藥是一類血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，能夠阻斷腎素-血管緊張素發(fā)揮生物學(xué)活性，進(jìn)而降低血管張力，使血壓降低。通過降低血壓，在一定程度上可發(fā)揮抗AS的效果，因?yàn)楦哐獕簳寡軆?nèi)皮細(xì)胞受損，甚至壞死，進(jìn)而加速粥樣斑塊的形成，隨著血壓的降低，可減輕危險(xiǎn)因素對血管壁的不良作用。纈沙坦還具有抗AS作用，由于血管緊張素Ⅱ具有較強(qiáng)的致炎效應(yīng)，會介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素和TNF-α，而纈沙坦能夠有效地拮抗血管緊張素Ⅱ與其受體結(jié)合，進(jìn)而降低其生物學(xué)效應(yīng)，能夠減緩心血管受到炎癥物質(zhì)的破壞。本次研究也表明，C組大鼠經(jīng)過10周纈沙坦干預(yù)處理后，其血脂水平和炎癥因子較A組和B組均有所減少，說明纈沙坦在抗AS方面具有一定成效。

綜上所述，纈沙坦能夠有效地降壓的同時(shí)，可能減少部分炎癥因子釋放的作用，發(fā)揮其抗AS的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Takahashi M. Inflammatory cytokines in the pathogenesis of athemsclerosis [J]. Nippon Rinsho，2011，69（1）：30-36.

[2]Handayani D，Meyer BJ，Chen J，et al. A high-dose Shiitake mushroom increases hepatic accumulation of triacylglycerol in rats fed a high-fat diet：underlying mechanism [J]. Nutrients，2014，6（2）：650-662.

[3]高麗君，齊曉勇，王秀萍，等.纈沙坦對高脂模型大鼠AS及炎癥因子的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2012，32（21）：4694-4697.

[4]Novgorodtseva TP，Karaman IuK，Zhukova NV. Modification of fatty acid composition of polar and neutral lipids of blood and liver in rat in conditions of prolonged high-fat diet [J]. Biomed Khim，2013，59（6）：644-654.

[5]王慶麗，趙慧穎，馬小欣，等.纈沙坦對大鼠粥樣硬化動脈血管組織MCP-1及AT1R蛋白表達(dá)的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（31）：3861-3865.

[6]Han SN，Leka LS，Liehlenstein AH，et al. Effect of hydrogenated and satuated，relative to polyunsaturated，fat on immune and inflammatory responses of adults with moderate hypercholesterolermia [J]. J Lipid Res，2002，43（3）：445-452.

[7]孔翠文，閆慧，李靖，等.纈沙坦對尿酸性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2013，16（2）：644-649.

[8]Li JJ，F(xiàn)ang CH. Atheroscleritis is a more rational termfor the pathological entity currently known as atheroselerosis [J]. Med Hypotheses，2004，63（1）：100-102.

[9]Ridker PM. Rosuvastatin in the primary prevention of cardiovascular disease among patients with low levels of low-density lipoprotein cholesterol and elevated high-sensitivity C-reactive protein rationale and design of the JUPITER trail [J]. Circulation，2003，108（19）：2292-2297.

[10]張咪，楊華昱，陳海平，等.纈沙坦對糖尿病大鼠水代謝的影響及機(jī)制[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7（16）：7476-7481.

[11]Thymiakou E，Zannis VI，Kanlassis D. Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Spl modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids [J]. Biochemistry，2007，46（41）：1473-1483.

[12]陳欣，王琳，楊漢東，等.纈沙坦對炎性AS的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22（13）：1491-1493.

[13]Elisaf M. Effects of fibrates on serum metabolic parameters [J]. Curr Med Opin，2002，18（5）：269-276.

[14]劉少奎，王筱梅，陳士毅，等.纈沙坦抗氧化作用對血管損傷小鼠血管重構(gòu)的影響[J].中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2013，5（5）：513-515.

[15]Bonetti PO，Wilson SH，Rodriguez-Porcel M，et al. Simvasmtin preserves myocardial perfusion and coronary microvascular permeability in experimental hypercholesterolemia independent of lipid lowering [J]. J Am Coil Car diol，2002，40（3）：546-554.

（收稿日期：2014-03-19本文編輯：任念）