李延輝 葉仕英 何小杰 徐飛 袁煜宗

老年白內(nèi)障是目前世界上第一位致盲眼病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前臨床上尚無切實(shí)有效的預(yù)防藥物。因此，通過各種先進(jìn)研究技術(shù)的綜合應(yīng)用深入老年白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制，抓住凋亡相關(guān)基因在老年白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制從而研發(fā)相關(guān)分子作用靶點(diǎn)，已成為一項(xiàng)十分有益于防治老年白內(nèi)障的的課題[1-2]。Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，近年來相關(guān)資料顯示，caspase-3可能參與了LECs的凋亡和白內(nèi)障的形成[3-4]。目前對(duì)Fas/FasL系統(tǒng)的凋亡機(jī)制研究多數(shù)集中于其在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用及意義，而對(duì)該系統(tǒng)在老年白內(nèi)障發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚不明確[5-6]。本研究通過免疫組化法對(duì)老年白內(nèi)障患者及正常老年人的晶狀體上皮中caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，旨在初步探討caspase-3、Fas/FasL在老年白內(nèi)障發(fā)生過程中所具有的分子生物學(xué)功能，為預(yù)防老年白內(nèi)障發(fā)生及開發(fā)更有效的藥物治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007年9月-2012年2月本院眼科收治的老年白內(nèi)障患者25例為研究對(duì)象，其中男13例（13眼），女12例（12眼），年齡50~79歲，平均（62.4±2.6）歲。均在常規(guī)白內(nèi)障顯微手術(shù)過程中采用連續(xù)環(huán)形撕囊，晶狀體前囊膜的直徑約5 mm。另選擇暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科進(jìn)行老年人尸體解剖的眼球晶狀體前囊膜標(biāo)本10例，均證實(shí)無白內(nèi)障發(fā)生。兩組晶狀體前囊膜標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法檢測(cè)四組晶狀體前囊膜標(biāo)本中的細(xì)胞凋亡情況。TUNEL法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，操作方法及過程嚴(yán)格按照試劑盒要求步驟進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果判定：光鏡下觀察，LECs細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，而染為藍(lán)色的細(xì)胞核為正常LECs細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率：細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用免疫組化EnVision法檢測(cè)各組LECs中caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)。操作方法及過程嚴(yán)格按照EnVision法試劑盒要求步驟進(jìn)行。染色結(jié)果判斷[6]：LECs胞漿或胞膜內(nèi)見黃色或棕色顆粒為染色陽性。每張切片隨機(jī)選擇檢查5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。0%~5%為（-）；5%~10%為（+）；20%~35%為（++）；35%~50%為（+++）。（+）~（+++）記為陽性。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，計(jì)量資料比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用 字2檢驗(yàn)，各指標(biāo)之間關(guān)系分析采用等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組LECs的凋亡情況比較 研究組、對(duì)照組的LECs中凋亡細(xì)胞百分率分別為34.0%、2.0%。研究組凋亡細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.59，P<0.01）。

2.2 兩組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的表達(dá)比較 研究組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率分別為84.0%、60.0%、68.0%，而老年對(duì)照組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的陽性表達(dá)率為10.0%、10.0%、20.0%，兩組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=6.19、8.43、9.11，P<0.01）。見表 1。

表1 兩組LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平比較

2.3 LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)之間的關(guān)系 對(duì)LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在25例老年性白內(nèi)障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)水平均成正相關(guān)的關(guān)系（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。

3 討論

近年來研究表明，LECs的損害是白內(nèi)障發(fā)生過程中的早期事件，除先天性白內(nèi)障以外，其他類型的白內(nèi)障形成均與LECs發(fā)生凋亡密切相關(guān)。推測(cè)LECs發(fā)生凋亡后，致使LECs的密度降低，LECs下面的晶狀體纖維滲透壓失去平衡，最終部分晶狀體纖維的透明性和完整性受到不好的影響[7-8]。本研究結(jié)果顯示，研究組、對(duì)照組的LECs中凋亡細(xì)胞百分率分別為34.0%、2.0%。兩組凋亡細(xì)胞百分率比較，研究組顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示在老年白內(nèi)障的發(fā)生過程中，LECs發(fā)生凋亡可能是其細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在其中可能起重要的作用。

caspase-3是近年來發(fā)現(xiàn)執(zhí)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[9-10]，國外有研究發(fā)現(xiàn)，在亞硒酸鹽誘導(dǎo)大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程中，caspase-3酶活性增高并起關(guān)鍵作用，提示caspase-3可能參與了晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和白內(nèi)障的形成。國內(nèi)一些研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)caspase-3在白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。研究認(rèn)為促凋亡基因Fas與FasL的相互作用及其構(gòu)成的復(fù)雜體系，是多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制之一[11-12]。Fas屬于TNF家族的I型跨膜糖蛋白，而FasL屬于TNF家族的II型膜蛋白。兩者結(jié)合在凋亡過程中具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。目前對(duì)Fas/FasL系統(tǒng)的凋亡機(jī)制研究多數(shù)集中于其在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用及意義，而對(duì)該系統(tǒng)在白內(nèi)障發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究采用免疫組化法檢測(cè)老年白內(nèi)障患者及正常老年人的晶狀體上皮中凋亡相關(guān)基因caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)情況，結(jié)果表明兩組caspase-3、Fas、FasL蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），老年性白內(nèi)障患者LECs中caspase-3、Fas、FasL的陽性表達(dá)率均明顯高于正常老年對(duì)照組，同時(shí)對(duì)LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在25例老年性白內(nèi)障患者中，LECs凋亡與caspase-3和Fas、FasL表達(dá)水平均成正相關(guān)的關(guān)系（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。這提示caspase-3、Fas/FasL均可能參與了老年白內(nèi)障形成過程，且在老年性白內(nèi)障形成過程中具有比較重要的作用。推測(cè)LECs受到外界各種不同刺激后，caspase-3蛋白酶系統(tǒng)首先被激活，晶狀體內(nèi)外鈣離子流動(dòng)失去正常時(shí)的平穩(wěn)狀況，細(xì)胞骨架及晶體連接蛋白逐漸被降解；同時(shí)也激活了FasL-Fas系統(tǒng)，大量FasL-Fas表達(dá)并結(jié)合，從而提供誘導(dǎo)凋亡的傳導(dǎo)信號(hào)，晶體連接蛋白進(jìn)一步被降解，水電平衡失調(diào)以及LECs發(fā)生大量凋亡的病理改變，推動(dòng)白內(nèi)障的形成進(jìn)程[13-15]。

綜上所述，老年性白內(nèi)障形成過程可能與LECs的凋亡及caspase-3、Fas/FasL的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，相信隨著對(duì)老年白內(nèi)障形成機(jī)制的不斷深入了解及凋亡機(jī)制的逐漸明確，調(diào)節(jié)caspase-3、Fas/FasL表達(dá)的相關(guān)分子靶點(diǎn)藥物的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用，都將為預(yù)防老年白內(nèi)障及其非手術(shù)治療方案的研發(fā)提供新的指導(dǎo)方向。

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