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(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350)

灰樹(shù)花是擔(dān)子菌亞門，多孔菌目，多孔菌科，樹(shù)花屬中的一種大型真菌，又名貝葉多孔菌、栗子蘑、佛菌等，是一種食、藥兼用的珍稀食用菌。國(guó)內(nèi)外大量灰樹(shù)花藥理藥學(xué)科學(xué)研究證明，灰樹(shù)花胞內(nèi)胞外多糖具有顯著的降血糖、抗腫瘤、抗HIV病毒、抗肝炎以及改善免疫系統(tǒng)功能等功效。而在降血脂方面只有袁德云等曾對(duì)其水溶性多糖進(jìn)行過(guò)研究。本文對(duì)灰樹(shù)花菌絲體進(jìn)行了提取水溶性多糖進(jìn)行小鼠的降血脂實(shí)驗(yàn)研究。

1材料與方法

1.1 材料

昆明種雄性健康小鼠,體重20 g左右；灰樹(shù)花菌絲體干粉；高脂飼料(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)):小鼠基礎(chǔ)飼料添加 1% 膽固醇、0% 蛋黃粉、0.2% 膽酸鹽、10% 豬油、15% 蔗糖。

葡聚糖凝膠 Sephadex G200，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司；總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇試劑、高密度脂蛋白膽固醇，中生北控生物科技股份有限公司。

SP-2102PC分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；酶標(biāo)儀(Fcc)。

1.2 方法

1.2.1 灰樹(shù)花菌絲體多糖制備

取灰樹(shù)花菌絲體干粉加蒸餾水，至菌絲體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 60%，在冰水浴下超聲波破壁 10 min，然后加水稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%，水浴 6 h，80 ℃。上清液加3倍體積95%乙醇，12h，4℃。離心得到沉淀物Sevage法去蛋白，大孔樹(shù)脂吸附超濾，冷凍干燥得到白色絮狀物質(zhì)水溶性多糖(灰樹(shù)花菌絲體多糖) 。將樣品(灰樹(shù)花菌絲體) 配制成10 mg/mL 溶液，微孔過(guò)濾后上Sephadex G200柱層析(2×35)，超純水洗脫，流速0.3 mL/min，1.5 mL/管分部收集，苯酚-硫酸法檢測(cè)菌絲體多糖含量。

苯酚硫酸法的測(cè)定原理：利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測(cè)定。已糖在490 nm處有最大吸收，吸收值與含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：

葡萄糖溶液濃度為0.1%，按下表1-1配標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)液，添加順序?yàn)橄仍谠嚬苤屑悠咸烟侨芤海偬砑诱麴s水，5%苯酚，最后添加濃硫酸。在100℃水浴鍋加熱20分鐘，冷卻，利用分光光度計(jì)在490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖濃度和對(duì)應(yīng)吸光度繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1-1)，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=88.998x-0.4815(R2=0.999，n=7)

表1-1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)液配比

圖1-1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.2 降血脂實(shí)驗(yàn)

高血脂動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組：將30只小白鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，這5組分別是陰性對(duì)照組、高脂對(duì)照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組。陰性對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)，高脂對(duì)照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組用高脂飼料喂養(yǎng)，經(jīng)過(guò)14天的有效喂養(yǎng)后分析各組別小鼠血樣，確定高血脂建模成功。接下來(lái)高脂對(duì)照組、高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組繼續(xù)用高脂飼料，陰性對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)。同時(shí)高劑量給藥組、中劑量給藥組、低劑量給藥組，利用不同劑量的灰樹(shù)花菌絲體多糖灌胃，高脂對(duì)照組、陰性對(duì)照組用生理鹽水灌胃，見(jiàn)表1-1。再經(jīng)過(guò)14 天后摘小鼠眼球取血,測(cè)定小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。采用組間t檢驗(yàn)法。

表 1-1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

2結(jié)果與分析

2.1 純度鑒定

柱層析分析：葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過(guò)葡聚糖凝膠層析柱，各個(gè)組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動(dòng)。分子量大的先流出來(lái)，分子量小的后流出來(lái)，最終可以分離出不同分子量的化學(xué)組分。葡聚糖凝聚層析具有穩(wěn)定性好、吸附性小等優(yōu)點(diǎn)。SephadexG200的分離范圍5-60kDa。從圖2-1可以看出，灰樹(shù)花菌絲體多糖是一種分子量均一組分。

2.2 降血脂實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

如表2-1，灰樹(shù)花菌絲體多糖 在中、高劑量給藥下,具有較顯著的調(diào)節(jié)小鼠血脂代謝的作用。高血脂癥小鼠總膽固醇 (TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)的指標(biāo)明顯降低，隨著菌絲體多糖劑量的增加，高血脂癥小鼠的總膽固醇 (TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)的指標(biāo)降低越明顯。中劑量組中小鼠血清中總膽固醇(TC)與高脂對(duì)照組相比降低28.2%、甘油三脂(TG) 高脂對(duì)照組相比降低30.8%、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) 與高脂對(duì)照組相比53.0%，具有明顯降低作用。中劑量組HDL-C/TC 值與高脂對(duì)照組相比升高9.9%，高劑量組HDL-C/TC 值與高脂對(duì)照組相比升高45.5%,都有顯著升高作用。雖然高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)變化不大，但是HDL-C：TC隨著劑量的增加而增大，這個(gè)比值越大說(shuō)明它的抗動(dòng)脈能力越強(qiáng)。其中中劑量組(50 mg/kg·d)血脂各項(xiàng)指標(biāo)最接近陰性對(duì)照組。

圖3-6 菌絲體多糖Sephadex G200凝膠過(guò)濾圖譜

組別cTC/(mmol L-1)cTG/ (mmol L-1)cHDL-C/ (mmol L-1)cLDL-C/ (mmol L-1)cHDL-C:cTC陰性對(duì)照4.28±0.341.87±0.211.63±0.211.65±0.140.376±0.011高脂對(duì)照8.13±0.942.66±0.332.45±0.143.13±0.230.312±0.034低劑量組7.54±0.652.66±0.242.24±0.322.23±0.40*0.311±0.023中劑量組5.84±0.82*1.84±0.45*2.21±0.331.47±0.19***0.343±0.065*高劑量組4.24±0.74**1.30±0.34***2.03±0.211.05±0.17***0.454±0.053**

注: 低、中、高劑量組：(25、50、100 mg/(kg·d)) 與陽(yáng)性對(duì)照比較*P< 0. 05 ,**P< 0. 01***P< 0. 001.

3討論

灰樹(shù)花菌絲體多糖經(jīng)過(guò)提取純化，通過(guò)Sephadex G200凝膠柱層析，鑒定認(rèn)為灰樹(shù)花菌絲體多糖為均一組分。

灰樹(shù)花菌絲體多糖之所以能調(diào)節(jié)血脂可能是由于多糖能夠在加快肝膽循環(huán)，有效增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)制，使肝內(nèi)生存的酮體和肝外組織所能利用的限度達(dá)到很好的一個(gè)平衡，從而降低了血脂在血液中的堆積。最終達(dá)到一種降血脂的作用。

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