林稱意 原 野 羅衛(wèi)民 郭家龍

食管癌屬于十大常見的惡性腫瘤之一，但癌前病變具有雙向發(fā)展的不穩(wěn)定性生物學(xué)特征，可向癌的方向發(fā)展或維持多年不變，也可退回到較輕度的病變，早預(yù)防、早診斷及早治療具有重要意義。我們分析TSLC1和CD105在食管癌組織中的表達(dá)，探討其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院收治的86例通過手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為食管癌的患者，術(shù)前未進(jìn)行任何抗癌治療。男性51例，女性35例，年齡43～71歲，平均(60.8±5.6)歲；23例患者腫瘤僅浸潤淺肌層、黏膜層或黏膜下層，63例患者腫瘤浸潤至深肌層或外膜層；患者中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例；病理分級：低分化24例，中分化32例，高分化30例。病理分期按照國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期11例，Ⅱ期25例，Ⅲ期40例，Ⅳ期10例。

1.2 試劑和儀器

鼠抗人CD105單克隆抗體(購自福州邁新公司)；SP試劑盒和DAB顯色劑(購自北京中杉金橋公司)；雙目顯微鏡、顯微照相儀(日本Olympus公司)；電熱手提式壓力蒸汽滅菌器(上海醫(yī)用核子儀器廠)。

1.3 免疫組化

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測法 取食管癌患者癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行脫蠟水化，使用胰蛋白酶消化抗原行CD105修復(fù)。然后PBS洗3次×5 min，室溫下3% H2O2溶液孵育10 min，滴加PBS液稀釋的一抗(CD105：1∶15)，放置于4℃冰箱孵育過夜，再次PBS清洗后滴加生物素化二抗工作液，室溫下孵育20 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育20 min，之后DAB底物顯色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固。

1.3.2 陽性判定標(biāo)準(zhǔn) 隨機選取每張切片中的10個高倍視野(400倍)，在每個高倍視野中計數(shù)200個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強度計數(shù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。TSLC1陽性反應(yīng)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，以≥25% TSLC1蛋白呈陽性著色作為陽性表現(xiàn)。CD105陽性標(biāo)準(zhǔn)為≥10%血管內(nèi)皮細(xì)胞染色呈棕色或棕黃色。

1.3.3 微血管密度(MVD)計數(shù) MVD計數(shù)方法：先在低倍鏡下(100倍)觀察切片尋找高血管密度區(qū)，然后在高倍鏡下(400倍)計算微血管的數(shù)目。高血管密度區(qū)必須與癌組織相連或位于癌組織內(nèi)部。選擇5個視野記錄微血管數(shù)，取平均值作為MVD值。

1.4 RT-PCR檢測TSLClmRN的表達(dá)

1.4.1 RT-PCR檢測方法 TSLCl引物序列：正向引物5'-CATAGTTGTCATCCAGAACCCAG-3'，反向引物5'-GCTCCAGACCTTGCCATTTT-3'；β-actin引物序列：正向引物5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'，反向引物5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3'。采用Trizol法分別從食管癌組織和癌旁正常組織中提取總RNA，測定RNA濃度、純度及完整性，按照strandeDNAsynthesisKit說明書操作，將總RNA翻轉(zhuǎn)為cDNA，行PCR擴增，94℃預(yù)變性2 min，之后循環(huán)35次94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，然后72℃總延伸6 min，4℃保存，最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.2 結(jié)果判定 采用凝膠圖像分析儀照相并觀察，陽性標(biāo)準(zhǔn)為凝膠中出現(xiàn)TSLC1：1367 bp，β-actin：564 bp的熒光條帶。計算條帶的積光密度IA，目的片段的相對表達(dá)強度(IA值)=目的片段的IA值/β-actin的IA值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TSLC1表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)檢測顯示TSLC1在食管癌組織的陽性率明顯低于癌旁正常組織的陽性率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05；凝膠電泳顯示，食管癌組織中TSLClmRNA(1367 bP)條帶清晰，無雜帶擴增，設(shè)計引物條帶產(chǎn)物與目的基因片段產(chǎn)物大小吻合，與癌旁正常組織相比，亮度較暗。TSLClmRNA在食管癌組織中相對表達(dá)強度明顯低于在癌旁正常組織中的相對表達(dá)強度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。免疫組織化學(xué)檢測顯示食管癌組織CD105的陽性率明顯高于癌旁正常組織的陽性率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05；食管癌組織中的MVD值明顯高于癌旁正常組織的MVD值，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。見表1。

表1 TSLC1與CD105蛋白在食管癌組織和癌旁正常組織中表達(dá)

2.2 TSLC1和CD105陽性表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

TSLC1陽性表達(dá)與TNM分期、病理分級相關(guān)，P<0.05；CD105陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期、病理分級有關(guān)，P<0.05。見表2。

表2 食管癌組織中TSLC1和CD105陽性表達(dá)情況(例，%)

3 討論

食管癌是以鱗狀細(xì)胞癌最為多見的發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多階段、多步驟、多基因相互作用的復(fù)雜過程，是多因素共同作用的結(jié)果，包括間質(zhì)微血管環(huán)境的建立及其實質(zhì)細(xì)胞遺傳上的分子生物學(xué)改變等因素[1-2]。了解食管癌的發(fā)生發(fā)展機制有助于食管癌的診斷和治療。

TSLC1是1種抑癌基因，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞運動及細(xì)胞間黏附，并在抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)[3]報道TSLC1可廣泛表達(dá)于除骨骼肌外的大多數(shù)正常組織中，但在許多腫瘤中特別是侵襲性強的腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)。Yang等[4]運用RT-PCR對鼻咽癌患者進(jìn)行檢測，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中35%存在TSLC1蛋白的表達(dá)缺失，而未轉(zhuǎn)移的原發(fā)鼻咽癌患者有12%存在TSLC1蛋白的表達(dá)缺失，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明TSLC1可考慮作為判斷鼻咽癌患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險性指標(biāo)。張典等[5]檢測發(fā)現(xiàn)TSLC1在45例食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率分別為44.4%和75.6%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示TSLC1在食管癌組織的陽性率為37.2%，明顯低于癌旁正常組織的陽性率81.4%，TSLClmRNA在食管癌組織中相對表達(dá)強度明顯低于在癌旁正常組織中的相對表達(dá)強度，與文獻(xiàn)報道相一致。

新生血管的生成在惡性腫瘤的生長、浸潤及其轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著十分重要的作用。CD105為同型二聚體細(xì)胞膜糖蛋白，參與轉(zhuǎn)化生長因子B(TGF-B)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤組織內(nèi)幼稚的血管起源的內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，可作為新生血管的標(biāo)志。文獻(xiàn)[6]報道CD105在口腔鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)，其標(biāo)記的MVD值與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、分期顯著相關(guān)，與患者的生存期也存在相關(guān)性，能夠作為獨立的預(yù)后指標(biāo)。Sallinen等[7]報道卵巢癌間質(zhì)內(nèi)CD105標(biāo)記的MVD特異性高，血管形成可能促進(jìn)病情發(fā)展并影響預(yù)后，使用CD105評估新血管生成是預(yù)測卵巢癌進(jìn)展危險度的有價值指標(biāo)。本研究檢測結(jié)果顯示食管癌組織CD105的陽性率為82.6%，明顯高于癌旁正常組織的陽性率8.1%，食管癌組織中CD105標(biāo)記的MVD值明顯高于癌旁正常組織的MVD值。劉宏斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)CD105標(biāo)記的MVD在食管鱗癌和正常食管組織中的均數(shù)分別為36.363±8.227、9.900±2.331，食管鱗癌組明顯高于正常食管組，單、多因素分析顯示CD105標(biāo)記的MVD是影響預(yù)后的主要因素，本研究結(jié)果與其相一致。對于TSLC1和CD105與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，朱冰等[9]應(yīng)用免疫組化檢測50例食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中TSLC1基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TSLC1表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織浸潤深度及TNM分期有關(guān)，食管癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常食管組織。本研究結(jié)果顯示TSLC1的陽性表達(dá)率在TNM的不同分期、病理的不同分級間存在明顯差異，CD105的陽性表達(dá)率在是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同浸潤深度、TNM的不同分期、病理的不同分級間存在明顯差異。提示TSLC1的陽性表達(dá)率隨著病情發(fā)展而下降，CD105的陽性表達(dá)率隨著病情的發(fā)展而升高。

TSLC1和CD105在食管癌中的作用機制還需進(jìn)一步研究，兩者有可能作為食管癌診斷、進(jìn)展及預(yù)后判斷的有效指標(biāo)，為食管癌的治療提供新的靶點。

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