高原，鄒陽(yáng)，于影，林金德，張春麗，溫傳俊，沈干

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院 科教辦，江蘇 南京 210029； 2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 分子細(xì)胞生物學(xué)研究所，江蘇 南京 210023； 3.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 整形外科，江蘇 南京 210003)

成熟的microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA(約22 nt)，通過(guò)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合靶mRNAs的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)[1-2]。

miRNAs具有組織特異性及發(fā)育時(shí)序性[3]，與靶基因之間是多對(duì)多的關(guān)系，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNAs的異常表達(dá)常常與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，例如腫瘤[4]、關(guān)節(jié)炎[1]和心血管疾病[5]等，因此關(guān)于miRNAs的檢測(cè)技術(shù)和方法對(duì)研究其作用機(jī)制以及相關(guān)疾病的診斷治療具有重要意義。迄今為止，檢測(cè)miRNA表達(dá)水平的方法已得到迅速發(fā)展，主要包括Northern blot[6-7]、微陣列芯片[8]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[9]等方法，總體上可將其歸為探針雜交技術(shù)和樣本擴(kuò)增技術(shù)[10]。然而相比這些方法不能檢測(cè)miRNA活性的缺點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)是一種能夠檢測(cè)miRNA活性的生物傳感器。本研究旨在利用雙熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建miR-140生物傳感器，并進(jìn)行初步應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SD大鼠由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；psiCHECK-2載體為本課題組實(shí)驗(yàn)室保存；引物由上海生工生物工程公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ購(gòu)自TaKaRa公司；microRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成(miR-140 mimics為內(nèi)源性成熟miR-140的模擬物)；胎牛血清、α-MEM購(gòu)自Gibco公司；DMEM購(gòu)自Wisent公司；轉(zhuǎn)染試劑GenEscortTMI購(gòu)自Wisegen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 miR-140 sensor的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)采用含雙熒光素酶報(bào)告基因的psiCHECK-2為載體。針對(duì)miR-140成熟體序列設(shè)計(jì)含4個(gè)拷貝反義序列的寡聚核苷酸(表1)，畫(huà)線(xiàn)部分分別為4個(gè)拷貝的反義序列和miR-140成熟體序列，于95 ℃ 3 min自然冷卻至室溫，磷酸化后與XhoⅠ、NotⅠ雙酶切的psiCHECK-2載體連接，16 ℃過(guò)夜。取5 μl轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)。挑取克隆提質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。

表1miR-140的靶序列

Tab1miR-140targetsequence

序列名稱(chēng)寡聚核苷酸序列正義鏈5'-TCGAGCTACCATAGGGTAAAACCACTGCTACCATAGGGTAAAACCACTGCTACCATAGGGTAAAACCACTGCTACCATAGGGTAAAACCACTGC-3'反義鏈5'-GGCCGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGC-3'

1.3 rat MSCs的分離、純化培養(yǎng)

選取健康4周齡的SD雄性大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量在80～100 g，將其脫臼處死后置于體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡約5 min并在無(wú)菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨。用注射器吸取10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基將骨髓沖出，制成單細(xì)胞懸液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)。48 h更換培養(yǎng)基，每3 d換液1次。

1.4 rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)

將rat MSCs接種于6孔板，24 h后更換成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，培養(yǎng)7 d后提取RNA。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)液(含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉),1% FBS,1%抗生素,10 ng·ml-1TGF-β1,1% ITS,40 μg·ml-1脯氨酸,100 nmol·L-1地塞米松，50 μg·ml-1維生素C。對(duì)照培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)液(含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉),1% FBS,1%抗生素。

1.5 RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

參照Trizol reagent說(shuō)明書(shū)(Invitrogen)提取RNA；采用50 ℃特異性反轉(zhuǎn)錄miR-140；RT-qPCR以RNU6-1為內(nèi)參，采用SYBR Green I嵌合熒光法，退火溫度為65 ℃，用2-ΔΔCt定量法分析數(shù)據(jù)結(jié)果。引物序列見(jiàn)表2。

表2RT-qPCR的引物序列

Tab2RT-qPCRprimersequences

RNA引物名稱(chēng)序列miR-140RT75'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCAT-3'F185'-ACACTCCAGCTGGGCAGTGGTTTTACCCTATG-3'通用反向5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'RNU6-1正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性分析

轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞接種于24孔板，miR-140 sensor(0.5 μg)和miR-140 mimics(20 nmol·L-1、50 nmol·L-1)共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)；miR-140 sensor(0.5 μg)轉(zhuǎn)染rat MSCs，24 h后更換成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，設(shè)對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。熒光素酶活性檢測(cè)采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒和熒光化學(xué)發(fā)光微孔板檢測(cè)儀，所得數(shù)值為海腎與螢火蟲(chóng)熒光素酶活性的比值。

2 結(jié) 果

2.1 miR-140 sensor的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)獲得的miR-140成熟序列設(shè)計(jì)4個(gè)拷貝反義序列，將其插入psiCHECK-2上的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，可轉(zhuǎn)錄出融合基因的mRNA，能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的miR-140，同時(shí)熒光信號(hào)降低，螢火蟲(chóng)熒光素酶的酶活作為內(nèi)參(圖1)。

T7：T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子；Rluc：海腎熒光素酶基因；miR-140T：miR-140靶結(jié)合位點(diǎn)；poly(A)：多聚腺苷酸；HSV-TK：HSV-TK啟動(dòng)子；Fluc：螢火蟲(chóng)熒光素酶基因

圖1miR-140sensor的結(jié)構(gòu)示意圖

T7:T7 RNA polymerase promoter;Rluc:Renilla luciferase gene;miR-140T:miR-140 target sequence;poly(A):polyadenylic acid;HSV-TK:HSV-TK promoter;Fluc:Firefly luciferase gene

Fig1SchematicmapofmiR-140sensor

2.2 miR-140 sensor的功能驗(yàn)證

將miR-140 sensor與20 nmol·L-1、50 nmol·L-1的miR-140 mimics共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-140 mimics能降低49%(P=0.001 4)、65%(P=0.001 9)的熒光活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-140 sensor可通過(guò)結(jié)合miR-140抑制海腎熒光素酶的熒光活性反映miR-140活性(圖2)。

P：psiCHECK-2；miR-140：miR-140 mimics；NC：短片段雙鏈RNA陰性對(duì)照；Sensor：miR-140 sensor

圖2miR-140sensor的功能分析

P:psiCHECK-2;miR-140:miR-140 mimics;NC:Negative Control;Sensor:miR-140 sensor

Fig2FunctionalanalysisofmiR-140sensor

2.3 miR-140 sensor在成軟骨誘導(dǎo)分化中測(cè)定miR-140活性

miR-140已被證實(shí)在成軟骨誘導(dǎo)分化中表達(dá)水平上升，因而將rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)7 d后，根據(jù)RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3a)，誘導(dǎo)組的miR-140表達(dá)水平顯著上調(diào)(P=0.000 7)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-140 sensor的功能，將其轉(zhuǎn)染rat MSCs，24 h后成軟骨誘導(dǎo)7 d(圖3b)，誘導(dǎo)組miR-140 sensor的熒光素酶活性降低43%(P=0.014 1)，提示miR-140活性升高。

(a) RT-qPCR法檢測(cè)rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)中miR-140的表達(dá)水平；(b) Luciferase分析rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)中miR-140 sensor的熒光素酶活性

圖3miR-140sensor在成軟骨誘導(dǎo)中的應(yīng)用

(a) Relative miR-140 expression level by RT-qPCR analysis in chondrogenesis of rat MSCs;(b) Relative luciferase activity of miR-140 sensor by luciferase analysis in chondrogenesis of rat MSCs

Fig3ApplicationofmiR-140sensorinchondrogenesis

3 討 論

miRNAs通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-13]。其中，miR-140被認(rèn)為參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程并作為潛在的治療靶點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。骨關(guān)節(jié)炎是較為常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，與年齡密切相關(guān)[14]。miR-140對(duì)軟骨的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用，若其功能缺失則可產(chǎn)生類(lèi)似骨關(guān)節(jié)炎的現(xiàn)象。其在人類(lèi)軟骨形成中表達(dá)增加并且豐富存在于軟骨組織，然而在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中，miR-140的表達(dá)水平顯著降低[15-16]。

RT-qPCR法作為常用的miRNAs檢測(cè)方法具有高靈敏度、特異性好，但是操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、模板質(zhì)量要求高且只能檢測(cè)miRNAs的表達(dá)水平，不能反映miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的活性。然而將miRNAs的反義重復(fù)序列插入熒光素酶報(bào)告基因的3′UTR構(gòu)建成miRNAs傳感器，可通過(guò)報(bào)告基因的熒光活性來(lái)反映miRNAs的活性。普洛麥格公司研發(fā)了一種將螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶組合的雙報(bào)告基因載體psiCHECK-2，海腎熒光素酶的3′UTR含有多克隆位點(diǎn)可插入靶基因序列，螢火蟲(chóng)熒光素酶作為內(nèi)對(duì)照使測(cè)量結(jié)果正態(tài)化，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏。

本研究將miR-140的反義重復(fù)序列插入psiCHECK-2載體構(gòu)建miR-140 sensor，并進(jìn)行驗(yàn)證以及應(yīng)用于在rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)中反映miR-140的活性變化，結(jié)果與RT-qPCR法檢測(cè)的miR-140表達(dá)水平相一致，證明miR-140 sensor是一種可進(jìn)行miR-140活性分析的生物傳感器。

[1] NAKASA T,NAGATA Y,YAMASAKI K,et al.A mini-review:microRNA in arthritis[J].Physiol Genomics,2011,43(10):566-570．

[2] CHI S W,HANNON G J,DARNELL R B.An alternative mode of microRNA target recognition[J].Nat Struct Mol Biol,2012,19(3):321-327．

[3] KROL J,LOEDIGE I,FILIPOWICZ W.The widespread regulation of microRNA biogenesis,function and decay[J].Nat Rev Genet,2010,11(9):597-610．

[4] IORIO M V,CROCE C M.MicroRNA dysregulation in cancer:diagnostics,monitoring and therapeutics.A comprehensive review[J].EMBO Mol Med,2012,4(3):143-159．

[5] 毛安瓊,姚怡,段曉霞,等.MicroRNA與心血管疾病[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(6):801-804．

[6] PALL G S,HAMILTON A J.Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA[J].Nat Protoc,2008,3(6):1077-1084．

[7] KIM S W,LI Z,MOORE P S,et al.A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs[J].Nucleic Acids Res,2010,38(7):e98．

[8] ZHAO B,JIN L,WEI J,et al.A simple and fast method for profiling microRNA expression from low-input total RNA by microarray[J].IUBMB Life,2012,64(7):612-616．

[9] BENES V,CASTOLDI M.Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR,how to use it and what is available[J].Methods,2010,50(4):244-249．

[10] 景花,宋沁馨,周?chē)?guó)華.MicroRNA定量檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].遺傳,2010,32(1):31-40．

[11] CHENG A M,BYROM M W,SHELTON J,et al.Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis[J].Nucleic Acids Res,2005,33(4):1290-1297．

[12] HUANG J,ZHAO L,XING L,et al.MicroRNA-204 regulates Runx2 protein expression and mesenchymal progenitor cell differentiation[J].Stem Cells,2010,28(2):357-364．

[13] GAROFALO M,CONDORELLI G L,CROCE C M,et al.MicroRNAs as regulators of death receptors signaling[J].Cell Death Differ,2009,17(2):200-208．

[14] 吳春彪,陸軍,王宸.晚期糖基化終末產(chǎn)物在骨關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2012,40(3):356-360．

[15] MIYAKI S,NAKASA T,OTSUKI S,et al.MicroRNA-140 is expressed in differentiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-1 responses[J].Arthritis Rheum,2009,60(9):2723-2730．

[16] MIYAKI S,SATO T,INOUE A,et al.MicroRNA-140 plays dual roles in both cartilage development and homeostasis[J].Genes Dev,2010,24(11):1173-1185．