王 鎮(zhèn) 張 勇 吳 懇 金水晶 蘇 婭 周代峰 邱逸敏 黃 玲 晏輝芳

(海南省干部療養(yǎng)院，海南 海口 571100)

原發(fā)性高血壓(essentialhypertension, EH)是遺傳與環(huán)境因素的交互作用的結(jié)果，是心腦血管疾病發(fā)生的獨立危險因素。內(nèi)皮素-1(ET-1)是由血管內(nèi)皮細胞分泌的血管收縮肽，也是迄今所致人體內(nèi)最強烈的血管收縮劑，參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程。近些年研究發(fā)現(xiàn)該基因與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)?；蚨鄳B(tài)性是形成個體差異的遺傳基礎(chǔ)，也是很多疾病發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)。獲得ET-1基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性，對原發(fā)性高血壓的防治具有重要意義。本研究擬探討ET-1基因的三個多態(tài)性位點ET-1+138A/-、 K198N、G8002A與海南漢族EH的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1對象 EH組：隨機選取2010～2013年于海南省老年病醫(yī)院住院的海南籍漢族無血緣關(guān)系的EH病人201例，診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)與國際高血壓學(xué)會(ISH)和2004年中國高血壓防治指南標(biāo)準(zhǔn)，即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg。所有入選者排除繼發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤及嚴(yán)重肝腎功能損害。正常對照組：隨機選取海南籍漢族健康居民311例，無血緣關(guān)系和高血壓家族史，排除冠心病、糖尿病、腫瘤、肝腎功損害者。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成 從GenBank中獲得人類ET-1基因的DNA全序列和mRNA序列, 用PRIMER6.0 軟件輔助設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。見表1。

1.2.2基因多態(tài)性檢測 ①PCR擴增：每個多態(tài)位點均設(shè)立2個PCR檢測管, 分別加入寡核苷酸正常和突變引物用于檢測每個多態(tài)位點正常和突變的等位基因。反應(yīng)總體積為20 μl，反應(yīng)體系：1×PCR緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.1～0.15 μmol/L，4種dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶(康為世紀(jì))1 U。加入1滴石蠟油覆蓋。反應(yīng)時，先加入3 μl模板 DNA 溶液，再加入上述混合體系17 μl，最后加入1滴石蠟油覆蓋，接著在PCR儀中進行擴增。PCR循環(huán)參數(shù)：K198N位點和G8002位點：首先94℃進行2 min熱變性，隨后進行35個循環(huán)反應(yīng)(94℃30 s，56℃30 s，72℃50 s)，后72℃延伸10 min。+138A/-位點：首先94℃進行2 min熱變性，隨后進行36個循環(huán)反應(yīng)(94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s)，后72℃延伸10 min。4℃保存。②序列測定：隨機抽取上述送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行DNA 序列測定。③基因分型：每種ET-1基因突變位點都利用突變型引物和野生型引物同時進行兩管PCR擴增，根據(jù)每個樣品兩種等位基因擴增產(chǎn)物結(jié)果，可準(zhǔn)確判定樣品的基因類型。

表1 等位基因特異性PCR的引物序列及擴增片段長度

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 基因頻率采用基因計數(shù)法計算。研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度用χ2檢驗。組間基因型與等位基因頻率比較用χ2檢驗。采用SPSS16.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1三種ET-1基因多態(tài)位點的基因分型結(jié)果 見圖1。K198N位點檢測出198GG、198GT和198TT三種基因型,G8002A位點檢測出了8002GG、8002GA和8002AA三種基因型,+138A/-位點檢測出了138(4A4A)、138(4A3A)和138(3A3A)三種基因型。測序結(jié)果表明等位基因特異性PCR技術(shù)對ET-1基因+138A/-位點、K198N位點、G8002A位點和T8000C位點基因突變的分型結(jié)果與DNA測序結(jié)果相符，說明基因分型結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確率均較高。

M:100 bp DNA Ladder; 1、2, 3、4, 5、6 分別為+138A/-突變位點138(4A4A)、138(4A3A)、138(3A3A) 基因型樣本正常引物和突變引物的擴增結(jié)果，7、8, 9、10,11、12分別為K198N 突變位點198GG、198GT、198TT 基因型樣本正常引物和突變引物的擴增結(jié)果; 13、14、15、16、17、18分別為G8002A突變位點8002GG、8002GA、8002AA基因型樣本正常引物和突變引物的擴增結(jié)果。

2.2ET-1基因+138A/-、K198N、G8002A多態(tài)性與海南漢族EH的相關(guān)性 見表2、表3。兩組群體經(jīng)χ2檢驗,均符合Hardy-Weinberg平衡,說明該群體具有代表性。海南漢族原發(fā)性高血壓患者中，ET-1基因 +138A/-、 K198N位點基因型頻率與對照組比較有明顯差異。+138A/-、 K198N、G8002A 3個多態(tài)位點上的等位基因3A(+138A/-)、G(K198N)、G(G8002A)在高血壓患者組中分布頻率明顯高于對照組(P<0.05)。

表2 海南地區(qū)漢族正常人群和EH患者ET-1基因三種多態(tài)位點等位基因的頻率分布〔n(%)〕

表3 海南地區(qū)漢族正常人群和EH患者ET-1基因三個多態(tài)位點基因型的頻率分布〔n(%)〕

3 討 論

內(nèi)皮細胞生成的舒張因子和收縮因子的拮抗性平衡是影響血壓以及血管張力的關(guān)鍵〔1〕。一氧化氮、ET及血管緊張素II三者在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用，若三者失去平衡，則可導(dǎo)致高血壓發(fā)病〔2〕。ET-1是內(nèi)皮細胞合成的最強的血管收縮因子之一，在原發(fā)性高血壓中，該蛋白在血漿中的水平與高血壓的程度成正相關(guān)，且隨著靶器官損害程度而加重〔3，4〕。這充分說明ET在原發(fā)性高血壓的發(fā)生及發(fā)展過程中起著十分重要的作用?？到ㄈA等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)血漿ET-1濃度可作為判斷高血壓患者病情的指標(biāo)，除此之外，ET-1活性也是高血壓的危險因素。

ET-1的濃度及活性主要取決于其基因的變化，即突變。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是基因突變的一種形式，也是形成人類個體差異的遺傳基礎(chǔ)，研究ET-1基因SNP位點多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)，可能為原發(fā)性高血壓的診斷、預(yù)測及干預(yù)提供參考依據(jù)。ET-1的編碼基因EDN1位于6p23一p24，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因存在多態(tài)多態(tài)位點，例如轉(zhuǎn)錄起始部位1370TG，外顯子1的+138A-，內(nèi)含子1的+1932G/A，第198個密碼子K198N，第4外顯子的8000T/G等。本研究選取+138A/-、 K198N、G8002A 3個多態(tài)性位點作為研究對象。

K198N(Lys198Asn)是ET-1基因第158號密碼子中的G突變?yōu)門而導(dǎo)致了賴氨酸與天冬氨酸的轉(zhuǎn)換，是目前文獻中報道較多的多態(tài)位點〔6～8〕。ECTIM等在對歐洲人群的研究中發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與血壓水平相關(guān)，基因型TT患者的血壓高于其他基因型。本研究結(jié)果提示GG可能與海南人群原發(fā)性高血壓存在密切關(guān)聯(lián)。

+138A/-是位于5′-未翻譯區(qū)起始部位下游138 bp的一個插入缺失型變異位點.研究發(fā)現(xiàn)高血壓組與對照組有明顯差異性說明+138A/-的基因多態(tài)性與高血壓明顯相關(guān)。海南籍漢族高血壓患者中， 3A型攜帶者血壓更容易升高，3A型等位基因可能是血壓升高的一個危險因素。

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