胡寶山 許喜筠 郭元利 芮 鋼

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建 廈門 361003)

椎間盤退變的病因和發(fā)病機制是近年來的研究熱點，目前發(fā)現(xiàn)退變椎間盤中，均有細胞因子和炎癥介質(zhì)等物質(zhì)存在，但細胞因子和炎癥介質(zhì)在椎間盤內(nèi)的來源未見相關(guān)報道。本實驗旨在觀察椎間盤細胞受到誘導(dǎo)刺激能否自分泌產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13，進一步揭示退變椎間盤中MMPs的來源。

1 材料與方法

1.1材料 新西蘭大白兔40只，平均體質(zhì)量2.6 kg，雌雄不限，由廈門大學(xué)實驗動物部提供。主要試劑：120 kD纖維黏連蛋白(Fn，美國Chemicon公司)，TRIzol 試劑(美國MRC公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)，5×M-MLV 緩沖液、RNA酶抑制劑、100 bp DNA Marker、5 mmol/L dNTP Mixture、TaqTMDNA聚合酶(TaKaRa中國大連公司)。主要儀器：OLYMPUS CX-40顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式公司)，Gyroscan intera T 1.5磁共振儀(德國Philip公司)，高速離心機(德國Philip公司)。

1.2椎間盤細胞的分離和培養(yǎng) 新西蘭大白兔，空氣栓塞處死。無菌取椎間盤，刮除髓核并削除纖維環(huán)，顯露軟骨終板并用小刀片及剪刀小心削剪軟骨終板，將軟骨終板和纖維環(huán)組織分別放入盛有無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，離心得到軟骨終板細胞和纖維環(huán)細胞，加入10 ml DMEM/F12培養(yǎng)基吹打均勻后轉(zhuǎn)移到75 cm2培養(yǎng)瓶中在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代軟骨終板細胞大概10 d左右融合，原代纖維環(huán)細胞大約8 d融合，之后每3天換液1次，按時用倒置顯微鏡觀察、拍照。細胞增殖融合為單層幾乎覆蓋瓶底時用0.25%胰蛋白酶消化并進行細胞傳代。兩種細胞一般均為8 d左右傳代。因椎間盤髓核細胞經(jīng)多次培養(yǎng)只能原代成活，無法進行傳代，未進入實驗。

1.3施加120 kD Fn-f處理因素 將軟骨終板細胞接種到放有6孔培養(yǎng)板內(nèi)，以5×105/ml密度接種，每孔加入含10%的胎牛血清 DMEM-F12培養(yǎng)基1.5 ml，在5% CO2、37℃的孵育箱中培養(yǎng)。細胞貼壁80%融合后，吸出培養(yǎng)基，加入無血清DMEM-F12培養(yǎng)基后分成兩組：第1組加Fn終濃度為1 μmol/L作試驗組，第2組加入等量PBS作為對照，在6孔板內(nèi)培養(yǎng)36 h，用于提取總RNA半定量分析MMP-13的表達，同時對兩組細胞行MMP-13的免疫熒光檢測。纖維環(huán)細胞處理方法同上。

1.4RT-PCR檢測mRNA的表達 分別收集實驗組和對照組6孔板內(nèi)細胞，將細胞進行裂解后按前述方法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。獲得cDNA后按下面引物和反應(yīng)條件進行PCR反應(yīng)，電泳后觀察相應(yīng)條帶的表達情況，操作方法同前。MMP-13引物：上游 5’-TCTGGAAGCAGGACCAGA-3’；下游：5’-CATAAATATGCTGAGGTC-3’。

1.5MMP-13的免疫熒光顯色 取兩組第2代細胞爬片，用冷PBS液沖洗3次，3 min/次。新鮮配制的4%多聚甲醛固定30 min，3% H2O2甲醇溶液室溫浸泡10 min，以滅火內(nèi)源性過氧化物酶。用0.01 mol/L PBS洗3次，3 min/次。0.5%Triton×100(PBS配制)，孵育2次，10 min/次，PBS液沖洗3次，3 min/次。滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，以消除非特異性著色。甩去多余的封閉液，不沖洗。試驗組滴加1∶20稀釋的MMP-13單克隆抗體，對照組滴加等量PBS，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫45 min，0.01 mol/L PBS液洗3次，3 min/次。滴加1∶64稀釋的FITC二抗，37℃孵育30 min～1 h，綠色熒光鏡下觀測顯色，拍攝圖片。

2 結(jié) 果

2.1細胞的形態(tài)學(xué)觀察 椎間盤細胞經(jīng)過計數(shù)，以5×105個/ml密度接種，細胞活力95%左右。接種的細胞為圓形，核明亮而清楚，懸浮于培養(yǎng)基中。細胞大小略有差異。24 h后細胞開始貼壁，圓形增大，伸展形成突起，變得扁平透亮；48 h后貼壁細胞逐漸增多；第5天，大部分細胞已經(jīng)貼壁，軟骨細胞呈小三角形、多角形或短梭形。纖維環(huán)細胞于第3天大部分完成貼壁，呈梭型，并呈現(xiàn)旋渦樣同向生長趨勢(圖2)。髓核細胞集落樣生長，高倍鏡下如涂布樣，見圖1。由于細胞數(shù)量很少，無法完成傳代。8～10 d左右，原代細胞基本融合，形成單層，連接成片。傳代后的細胞一般36 h內(nèi)即可完全貼壁，7 d左右細胞形成單層融合。隨著傳代的次數(shù)增加，軟骨終板細胞逐漸增大，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，胞質(zhì)/核比例增大，細胞形態(tài)不規(guī)則。傳至第5代，細胞生長變慢。

2.2120 kD Fn-f對MMP-13 mRNA表達的影響 軟骨終板兩組內(nèi)參GAPDH均在理論條帶位置出現(xiàn)相應(yīng)條帶，有所表達。試驗組出現(xiàn)100～200 bp條帶，符合MMP-13 mRNA表達的理論值，說明在120 kD Fn-f的作用下終板軟骨細胞能夠表達MMP-13 mRNA。對照組沒有相應(yīng)條帶產(chǎn)生，說明終板軟骨細胞自身無刺激條件下不會表達MMP-13。纖維環(huán)細胞實驗組同樣得到MMP-13 mRNA的表達條帶，但是和軟骨終板細胞相比，表達量很少，而PBS對照組沒有相應(yīng)條帶的表達(圖2)。

終板軟骨細胞

纖維環(huán)細胞

原代髓核細胞

EP：終板軟骨細胞；AF：纖維環(huán)細胞

2.3熒光免疫顯色 試驗組軟骨終板細胞產(chǎn)生綠色熒光，說明在120 kD Fn-f誘導(dǎo)下軟骨終板細胞能產(chǎn)生MMP-13，纖維環(huán)組熒光表達量非常少，甚至不表達。對照組軟骨終板細胞和纖維環(huán)細胞沒有綠色熒光產(chǎn)生，沒有MMP-13的表達(圖3)。

終板軟骨細胞

纖維環(huán)細胞

3 討 論

終板軟骨細胞由于軟骨終板細胞為透明軟骨，故其細胞外基質(zhì)主要由Ⅱ型膠原和蛋白多糖組成，通過番紅-0對基質(zhì)中的蛋白多糖和甲苯胺蘭對糖胺多糖特異性染色，以及對Ⅱ型膠原進行免疫細胞化學(xué)染色，再結(jié)合取材的部位，即可鑒定是否是軟骨終板細胞。本實驗通過上述染色證實，所培養(yǎng)的細胞具有軟骨細胞的表型特征，即可以合成分泌蛋白多糖和Ⅱ型膠原，因此，可以證明所培養(yǎng)的細胞為軟骨終板細胞。

纖維環(huán)細胞目前為止還沒有特異的鑒定方法，一般來說根據(jù)取材的部位和細胞形態(tài)的描述。由于椎間盤組織為三明治結(jié)構(gòu)，和其他組織分界清楚，而且終板軟骨和纖維環(huán)雖然連接緊密，但是細胞形態(tài)截然不同，因此根據(jù)這兩點可以進行纖維環(huán)細胞的鑒定。一般來說當(dāng)細胞貼壁融合后，細胞形態(tài)成梭形，而且細胞呈現(xiàn)一種同向性生長趨勢，也就是細胞長軸方向相同，為旋渦樣或水流樣生長。本實驗所得細胞和上述描述基本相同。因此認為是纖維環(huán)細胞。其細胞類型應(yīng)該屬于成纖維細胞。兔細胞傳代過4代后，細胞形態(tài)會發(fā)生變化，多數(shù)細胞會變圓，同時細胞同向性生長趨勢消失。

髓核細胞由于數(shù)量稀少，細胞活力低下，本實驗只成功培養(yǎng)了兔椎間盤的原代髓核細胞。沒能成功進行傳代，可能其方法學(xué)還須進一步改進。其鑒定目前為止亦沒有標(biāo)準(zhǔn)方法，同樣需通過取材位置和細胞形態(tài)進行。細胞形態(tài)和軟骨終板細胞較為相似，亦呈現(xiàn)多角形，但是不同之處在于細胞偽足長、較多，胞質(zhì)向外突起，呈“涂布樣”?？赡苡捎谠年P(guān)系，細胞呈集落樣聚集，一般不能長滿瓶壁。

椎間盤退變主要表現(xiàn)在終板、髓核、纖維環(huán)中細胞和細胞外基質(zhì)的變化，其中基質(zhì)成分的病理改變在椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展過程中起著及其重要的作用，退變間盤基質(zhì)的變化主要表現(xiàn)在蛋白多糖的降解，非聚合性蛋白多糖成分增多，降解產(chǎn)物聚積；Ⅱ型膠原降解，濃度降低，Ⅰ型Ⅱ型膠原比例失調(diào)，研究表明在此過程中許多與基質(zhì)成分改變相關(guān)的蛋白酶類均參與了這一病理過程，其中以MMPs尤為重要。

MMPs主要有兩方面的功能，①幾乎能夠降解多糖以外的所有細胞外基質(zhì)成分。②激活其他酶類產(chǎn)生連鎖放大效應(yīng)。按MMPs的作用底物可分為四大類，即膠原酶包括MMP-1、MMP-8、MMP-13；明膠酶包括MMP-2、MMP-9；基質(zhì)溶解酶包括MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12；模型MMPs包括MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17。膠原酶為水解活動中最重要、最基本的酶類，只有膠原酶才能夠作用于膠原的螺旋區(qū)，膠原酶是基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶〔1〕。目前為止發(fā)現(xiàn)與椎間盤退變相關(guān)的MMPs主要包括：MMP-1、2、3、7、8、9、13七種，其家族中其他成員在椎間盤中的表達鮮見報道。1982年，Sedowofia等首先在人類腰椎間盤纖維環(huán)和髓核組織提取物中發(fā)現(xiàn)了中性膠原酶、明膠酶和彈性蛋白酶，有研究發(fā)現(xiàn)突出的頸、腰椎間盤中MMP-3、明膠酶及白細胞介素(IL)-6的含量高于正常椎間盤。退變、突出椎間盤中MMP-3、IL-1的含量和表達陽性率高于正常椎間盤組〔2〕。Gaetani等〔3〕發(fā)現(xiàn)緊鄰神經(jīng)根的突出椎間盤組織中MMP-3含量高于椎體軟骨終板表面的椎間盤組織。

MMP-13屬于膠原酶的一種，主要降解Ⅱ型膠原，它在椎間盤退變之間存在密切的關(guān)系。Anderson等〔4〕損傷兔的椎間盤制作椎間盤退變模型后檢測MMP-13等多種炎癥介質(zhì)和相關(guān)酶類的mRNA的表達發(fā)現(xiàn)MMP-13表達明顯升高，而對照組沒有MMP-13的表達。Maitre等〔5〕將人的腰椎間盤退變標(biāo)本行免疫組化發(fā)現(xiàn)包括MMP-13在內(nèi)的多種MMPs均有表達，或者表達較正常椎間盤明顯增多，并隨退變程度而有所增加。同時發(fā)現(xiàn)，正常椎間盤內(nèi)沒有MMP-13的表達，退變椎間盤內(nèi)表達較多。LeMaitre等〔6〕對IL-1和MMPs的表達之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠誘導(dǎo)人椎間盤細胞產(chǎn)生MMP-13，而對照組沒有MMP-13的產(chǎn)生。Yurube等〔7〕對兔椎間盤施加機械壓力制作的椎間盤退變模型后檢測蛋白酶類的基因表達時發(fā)現(xiàn)，MMP-13有所表達，而對照組沒有表達。以上研究均表明MMP-13參與了椎間盤退變的過程，而且多數(shù)學(xué)者認為炎癥介質(zhì)和基質(zhì)酶類似乎有一種因果關(guān)系，炎癥介質(zhì)產(chǎn)生后就會導(dǎo)致基質(zhì)酶類的產(chǎn)生。本實驗的第二部分已經(jīng)證實120 kD Fn-f誘導(dǎo)退變的椎間盤內(nèi)有MMP-13的表達。但是對于椎間盤內(nèi)MMP-13的來源仍不清楚，因此本部分實驗對椎間盤細胞在120 kD Fn-f的誘導(dǎo)下能否產(chǎn)生MMP-13進行了檢測。結(jié)果顯示軟骨終板細胞在120 kD Fn-f的誘導(dǎo)下，大量表達MMP-13 mRNA和MMP-13蛋白，表現(xiàn)為較亮電泳條帶和熒光顯色，說明軟骨細胞能夠表達MMP-13。纖維環(huán)細胞則表達量極少，幾乎不表達，說明纖維環(huán)細胞對120 kD Fn-f的刺激不敏感，或者說纖維環(huán)細胞本身不會大量表達MMP-13。由于髓核細胞和軟骨終板細胞更具有相似性，因此推測在120 kD Fn-f能夠誘導(dǎo)髓核細胞產(chǎn)生MMP-13，由于髓核細胞傳代沒有成功，因此只能推測。

4 參考文獻

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3Gaetani P,Rodriguez Y，Baena R,etal.Collagenase-1 and stromelysin distribution in fresh human herniated intervertebral disc:a possible link to the in vivo inflammatory reactions〔J〕.Neurol Res，1999;21(7):677-81.

4Anderson DG,Izzo MW,Hall DJ,etal.Comparative gene expression profiling of normal and degenerative discs:analysis of a rabbit annular laceration model〔J〕.Spine，2002;27(12):1291-6.

5Le Maitre CL,Freemont AJ,Hoyland JA.Localization of degradative enzymes and their inhibitors in the degenerate human intervertebral disc〔J〕.J Pathol，2004;204(1):47-54.

6Le Maitre CL,Freemont AJ,Hoyland JA.The role of interleukin-1 in the pathogenesis of human intervertebral disc degeneration〔J〕.Arthritis Res Ther，2005;7(4):R732-45.

7Yurube T,Takada T,Suzuki T,etal.Rat tail static compression model mimics extracellular matrix metabolic imbalances of matrix metalloproteinases,aggrecanases,and tissue inhibitors of metalloproteinases in intervertebral disc degeneration〔J〕.Arthritis Res Ther，2012;14(2):R51.