馬 晨 劉曉智 劉振林

(天津市第五中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 塘沽 300450)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)是最常見(jiàn)的機(jī)械性損傷之一，原因包括道路交通事故損傷、高空墜落損傷和攻擊損傷，極容易導(dǎo)致死亡，顱腦損傷占創(chuàng)傷總數(shù)15%，但死亡率卻占創(chuàng)傷總數(shù)的85%〔1〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和-9又稱(chēng)基質(zhì)溶素-1，主要由巨噬細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生成。TBI導(dǎo)致血腦屏障損傷，MMP-2 和 MMP-9對(duì)TBI死亡細(xì)胞的清除扮演著重要的作用，是調(diào)節(jié)TBI損傷的重要細(xì)胞因子之一。本研究探討大鼠顱腦損傷后MMP-2 和 MMP-9表達(dá)的變化及與損傷時(shí)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康成年SD大鼠96只，由本院中心實(shí)驗(yàn)室提供，體重(250±50)g，雌雄不分，置于安靜、溫暖、避強(qiáng)光的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)。

1.2試劑和裝置 試劑：MMP-2和MMP-9兔抗鼠單克隆抗體(購(gòu)于凱基生物公司)，二抗、DEPC及SABC試劑盒、DAB顯色劑等(購(gòu)于上海生工生物公司)。裝置：定向儀、PVC管、鐵制砝碼和鐵質(zhì)撞擊小錘組成(由中心實(shí)驗(yàn)室提供)。FTC-2000 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(由中心實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3大鼠腦外傷模型建立

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 運(yùn)用隨機(jī)數(shù)列表，把大鼠隨機(jī)分為A組(正常對(duì)照組)8只、B組(假損傷組)8只和C組(損傷組)80只。C組又分為10組,分別為C1組損傷后 (1 h)，C2組損傷后(6 h)，C3組損傷后(12 h)，C4組損傷后(24 h)，C5組損傷后(2 d)，C6組損傷后(3 d)，C7組損傷后(5 d)，C8組損傷后(7 d)，C9組損傷后(10 d)，C10組(14 d)共，每組8只。

1.3.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱?將大鼠稱(chēng)重后吸入乙醚麻醉后，剪去頂部鼠毛，按照0.35 g/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，消毒皮膚后，將大鼠固定于定向儀裝置內(nèi)，將撞擊小錘放入骨窗內(nèi)，沿中線切開(kāi)頭皮長(zhǎng)約1.5～2.5 cm，分離骨膜，用牙科鉆磨開(kāi)顱骨，以前囟后1.5 mm、中心右側(cè)2.5 mm為中心，形成直徑5 mm骨窗，保持硬腦膜完整。將鐵質(zhì)砝碼放入 PVC管并安裝在立體定向儀上，經(jīng)調(diào)節(jié)使鐵質(zhì)砝碼底面恰與撞擊小錘底面完全接觸。懸吊40 g鐵制砝碼，使之自25 cm高處自導(dǎo)管內(nèi)自由下落撞擊小錘。撞擊后即刻移開(kāi)砝碼，取出撞擊小錘，壓迫止血后用鋅汀粉封閉骨窗，縫合頭皮，置回鼠籠喂養(yǎng)。假損傷組只開(kāi)窗不撞擊，正常對(duì)照組不作任何處理。

1.4免疫組化染色 大鼠顱腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，用PBS沖洗3次后，用羊血清孵育，MMP-9兔抗鼠單克隆抗體作為一抗，SABC法免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，蘇木素復(fù)染，PBS作為陰性對(duì)照；另做常規(guī)HE染色。

對(duì)MMP-9免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)物進(jìn)行檢測(cè)，各組陽(yáng)性面積比及陽(yáng)性反應(yīng)物的平均光密度值。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)量 取大鼠顱腦組織，冰生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中保存?zhèn)溆?，用Trizol法提取總RNA(購(gòu)于上海生工生物公司)，取大鼠腦組織50～100 mg，采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。MMP-2：正義：5’- GCTGATACTGACACTGGTACTG-3’，反義：5’-CAA TCTTTTCTGGGAGCTC-3’，運(yùn)用探針：5’-GGAGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGAC GGACTCC-3’，長(zhǎng)度217 bp。 MMP-9：正義：5’- CACCGCCAACTATGACCAGGA-3’，反義：5’-AAGACGAAGGGGAAGACGCAC-3’，運(yùn)用探針：5’-FAM-ACTGTAACTGGGGGCAACTCGGCAGTA MRA-3’，長(zhǎng)度280 bp，引物都是由上海生工生物公司合成。

1.6明膠酶譜分析MMP-2和MMP-9表達(dá)量 實(shí)驗(yàn)前配制明膠緩沖液:100 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris和1 μmol/L ZnCl2；洗脫液:2.5% Triton X-100。取大鼠腦組織50～100 mg，勻漿、離心，組織蛋白抽提液,SDS-PAGE電泳用0.1%明膠的7.5%聚丙烯酰胺凝膠，用Marker作為對(duì)照。結(jié)束后用洗脫液漂洗，明膠緩沖液37℃孵育18 h,在緩沖液中加入EDTA 20 mmol/L、特異性抑制劑苯甲基磺酰胺20 mmol/L,以明確所得條帶的性質(zhì)。孵育結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)溶液染色1 h,脫色約45 min觀察條帶。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般表現(xiàn) C組大鼠出現(xiàn)呼吸深快或暫停現(xiàn)象，出現(xiàn)全身輕度抽搐，同時(shí)出現(xiàn)去皮層綜合征，如頸項(xiàng)強(qiáng)直、雙側(cè)前肢屈曲和下肢強(qiáng)直等。多數(shù)大鼠恢復(fù)后能自主呼吸，大約1 h可自主爬行；少數(shù)大鼠出現(xiàn)偏向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，但在6 h內(nèi)能恢復(fù)。A組和B組大鼠不出現(xiàn)上述癥狀，B組蘇醒后恢復(fù)正常活動(dòng)。

2.2MMP-2和MMP-9免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 C組中,MMP-2和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞在大腦皮層陽(yáng)性細(xì)胞呈深棕黃色，位于神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，表達(dá)量逐步增加，C1組出現(xiàn)陽(yáng)性染色，但顏色較弱，主要為神經(jīng)元；C2組染色程度與C3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C4-C5組MMP-2和MMP-9神經(jīng)元表達(dá)逐步增多，少量膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn) MMP-9陽(yáng)性染色；MMP-2在C7組染色強(qiáng)度達(dá)到高峰；MMP-9在C6組染色強(qiáng)度達(dá)到高峰；C7-C8組 MMP-2和MMP-9 陽(yáng)性染色逐步減弱，C9～C10組MMP-2和MMP-9表達(dá)量逐步穩(wěn)定。A組和B組中，MMP-2和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量極少,見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 MMP-2蛋白的表達(dá)變化(×400)

圖2 MMP-9蛋白的表達(dá)變化(×400)

2.3MMP-2和MMP-9免疫組化分析 大鼠顱腦損傷后MMP-2和MMP-9平均光密度值與陽(yáng)性面積比現(xiàn)出一個(gè)規(guī)律性變化，及升高-高峰期-逐漸下降期，A組與B組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-2和MMP-9平均光密度值， C3組、 C4組、 C5組、 C6組、 C7組、 C8組、 C9組和 C10組與A組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，損傷12 h后開(kāi)始顯著增強(qiáng)(與相鄰上組比較P<0.05)，MMP-2在5 d左右達(dá)到高峰，到14 d維持在較高水平;MMP-9在3 d左右達(dá)到高峰， 到14 d維持在較高水平。對(duì)于MMP-2和MMP-9陽(yáng)性面積比，顱腦損傷后C4組、C5組、C6組、C7組和C8組與A組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，損傷1 d后開(kāi)始顯著增強(qiáng)(與相鄰上組比較P<0.05)，MMP-2在5 d左右達(dá)到高峰,到7 d都維持在較高水平表達(dá)狀態(tài)，在傷后10 d表達(dá)明顯降低；MMP-9在3 d組時(shí)達(dá)到高峰，到5 d都維持在較高水平表達(dá)狀態(tài)，在傷后7 d表達(dá)明顯降低，具體見(jiàn)圖3、圖4。

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.05；與上一組比較:2)P<0.05；下圖同

圖4 腦損傷后MMP-2、MMP-9陽(yáng)性面積比的時(shí)相分布

2.4MMP-2和MMP-9 mRNA在各組的表達(dá)量 MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)規(guī)律性變化：升高-高峰-下降期。MMP-2在C7組(5 d)出現(xiàn)最高峰，10 d都維持在較高水平表達(dá)狀態(tài)，在傷后10 d表達(dá)明顯降低；MMP-9在C6組(3 d)出現(xiàn)最高峰，7 d都維持在較高水平表達(dá)狀態(tài)，在傷后7 d表達(dá)明顯降低，見(jiàn)圖5。

圖5 MMP-2、MMP-9 mRNA在各組的表達(dá)量

2.5明膠酶譜分析MMP-2和MMP-9表達(dá)量 MMP-2和MMP-9分子量分別為：64、83 kD；發(fā)現(xiàn)表達(dá)量現(xiàn)規(guī)律性變化：升高-高峰-下降期。MMP-2在C7組(5 d)出現(xiàn)最高峰，10 d都維持在較高水平表達(dá)狀態(tài)，在傷后10 d表達(dá)明顯降低；MMP-9在C6組(3 d)出現(xiàn)最高峰，7 d都維持在較高水平表達(dá)狀態(tài)，在傷后7 d表達(dá)明顯降低，見(jiàn)圖6。

圖6 明膠酶譜分析MMP-2和MMP-9表達(dá)量

3 討 論

TBI的神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制可能包括血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能受損、損傷后相關(guān)蛋白生成不足及細(xì)胞凋亡〔2〕。細(xì)胞凋亡是指在某些刺激誘導(dǎo)下，機(jī)體細(xì)胞膜信號(hào)被激活，啟動(dòng)調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因，導(dǎo)致細(xì)胞破壞或死亡。凋亡可能是通過(guò)啟動(dòng)減少細(xì)胞壞死，使細(xì)胞死亡變成主動(dòng)清除〔3〕。TBI后血腦屏障破壞的機(jī)制：由于外力的直接作用造成毛細(xì)血管破裂，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血壞死，血腦屏障完全受損，發(fā)生不可逆損害，起初僅為部分性損傷，但以后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)會(huì)有許多繼發(fā)性損害〔4〕。

本次研究發(fā)現(xiàn)，損傷后6 h出現(xiàn)了血腦屏障結(jié)構(gòu)的破壞和腦水腫，出現(xiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張,組織水腫、淤血和出血，腦組織出現(xiàn)炎癥。損傷1 d后神經(jīng)細(xì)胞水腫，血管擴(kuò)大，胞質(zhì)空泡形成；3 d后損傷區(qū)腦組織出現(xiàn)壞死，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和組織間隙出現(xiàn)明顯水腫現(xiàn)象，出現(xiàn)重度缺血性改變，發(fā)生繼發(fā)性腦損傷。

MMPs是一種鋅依賴性降解蛋白酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)分子，主要參與血管再生、炎癥反應(yīng)等過(guò)程〔5〕。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶，又稱(chēng)基質(zhì)溶素、前明膠酶，在細(xì)胞內(nèi)以前體形式存在〔6〕。MMP-2和MMP-9作用廣泛，常由結(jié)締組織細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，能降解纖維連接蛋白及Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型膠原等生成，在顱腦損傷后一系列病理生理過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，在血腦屏障開(kāi)放、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)重建等過(guò)程中發(fā)揮作用〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)證明在神經(jīng)元組織中，血腦屏障完整時(shí)MMP-2和MMP-9表達(dá)極少量，在顱腦硬膜外損傷后，血腦屏障中MMP-2和MMP-9起到重要的積極保護(hù)作用。隨著血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)，7 d后腦水腫和繼發(fā)性腦缺血缺氧逐漸減輕，改變了這種惡性循環(huán)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)逐漸恢復(fù)正常。

4 參考文獻(xiàn)

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