李家鑫 韋斌垣 歐俐羽 李 劍

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經內科，廣西 南寧 530021)

腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)基因與阿爾茨海默病(AD)的關系，已經引起人們的重視。BDNF能夠支持前腦、海馬及皮質膽堿能神經元的生存、分化和修復，并且在突觸可塑性中發(fā)揮了重要的作用，因此與學習和記憶有著密切的聯(lián)系。已有研究表明BDNF參與了AD的發(fā)病〔1〕，并有可能成為治療AD的手段〔2〕。本文將從BDNF基因的功能性多態(tài)(rs6265)層面來探討B(tài)DNF與散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取自2010年1月至2011年3月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經內科和江濱醫(yī)院神經內科住院的SAD患者58例，其中男性40例，女18例，年齡57～76〔平均(66.66±11.82)〕歲，病程1～16年，平均發(fā)病年齡(63.03±7.24)歲,平均病程(6.62±4.565) 年。所有患者均進行了臨床檢查、簡易智能狀態(tài)檢查(MMSE)和Hachinski缺血評分，并經過至少二名神經科專家診斷，均符合NINCDS-ADRDA“很可能AD”診斷標準〔3〕。排除外患嚴重軀體疾病、有抑郁癥狀和癡呆家族史者。對照組為同期52例在我院行體檢的健康老年人，其中男33例，女19例，年齡56～74〔平均(63.75±9.14)〕歲。兩組在年齡(U=0.953 2，P=0.339 8)和性別構成上(χ2=0.372 1，P=0.541 2)均無差異。均簽署知情同意書。

1.2主要材料 MJ PTC-220 PCR儀;紫外光凝膠電泳成像分析系統(tǒng)；血液基因提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司),2×TaqPCRMasterMix (北京康為世紀生物科技有限公司),瓊脂糖(北京天根生化科技有限公司),Gene finder核酸染料(Takara公司)，5×TBE〔生工生物工程(上海)有限公司〕，DNA marker(600 bp)(廣州東盛生物科技有限公司)，Eco72Ⅰ快速酶(Thermo公司)；人腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)快速檢測試劑盒(CUSABIO，CSB-E04501h)，Bio-RAD Imark酶標儀。

1.3血樣采集 所有患者均空腹采取靜脈血5 ml，將其中的2 ml沿管壁緩慢注入含肝素抗凝管中,立即于-70 ℃冷凍存放以行基因檢測；余下的緩慢注入非抗凝管中，室溫放置60 min后以1 000 r/min離心20 min，取血清分裝于EP管中，置-70 ℃低溫冰箱保存，以檢測BDNF。

1.4基因檢測 使用血液DNA提取試劑盒(離心柱型)提取血液DNA。BDNF基因G196A上游引物：5′-AAGAAGCAAACATCCGAGGACA-3′,下游引物：5′-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3′,引物由深圳華大基因科技有限公司合成。然后應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術擴增目的DNA片段并進行基因分型。PCR擴增循環(huán)條件：94℃起始5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)反應35次，72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經Eco72Ⅰ快速酶切，酶切產物即刻進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外光凝膠電泳成像分析系統(tǒng)上進行掃描、拍照，并進行圖像分析，對BDNF G196A進行基因分型。

1.5BDNF的檢測 采用人BDNF ELISA試劑盒測定，按說明書操作，最后用酶標儀讀數，取單波長450 nm，用空白孔調零，然后測定各孔光密度(OD值)。用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數2，即為樣品的實際濃度。

1.6統(tǒng)計學分析 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，樣本均數比較采用t檢驗，構成比比較采用χ2檢驗；基因型頻率和基因頻率采用基因計數法，吻合度檢驗確定是否符合Hardy-Weinberg平衡。

2 結 果

2.1BDNF多態(tài)性位點分析 BDNF G196A位點PCR產物的酶切電泳結果 PCR產物長度為500 bp，當等位基因為G時，PCR產物經Eco72Ⅰ酶切后形成131和369 bp片段，在凝膠電泳圖上顯示2條電泳帶；當等位基因為A時PCR產物不能被Eco72Ⅰ酶切，片段長度為500 bp，在凝膠電泳圖上顯示1條電泳帶；當等位基因為雜合型A/G時，在凝膠電泳圖上顯示3條電泳帶，見圖1。

2.2BDNF Val 66 Met多態(tài)性檢測

2.2.1Hardy-Weinberg 吻合度檢驗 兩組3種基因型觀察值與期望值檢測符合Hardy-Weinberg平衡定律(SAD組χ2=0.064，P=0.800；對照組χ2=0.076，P=0.783)，表明其基因型頻率分布已達到遺傳平衡，具有群體代表性。

M：Marker；2,3,5：AA基因型；4,6,7：AG基因型；1,8：GG基因型

2.2.2BDNF G196/A多態(tài)性與SAD的相關性分析 兩組中AA、AG及GG3種基因型頻率 (χ2=0.012 9，P=0.994)和A、G等位基因頻率的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.012 8，P=0.910)。按性別分層分析，兩組男性基因型頻率(χ2=0.302,P=0.860)和等位基因頻率(χ2=0.117,P=0.732)差異無統(tǒng)計學意義；女性的基因型頻率(χ2=0.780,P=0.677)和等位基因頻率(χ2=0.511,P=0.475)差異無統(tǒng)計學意義。<65歲的人群中，等位基因(χ2=6.059 5,P=0.013)及基因型分布(χ2=6.082 6,P=0.047 8)有顯著差異，而≥65的人群中則無差異。

2.3血清BDNF的表達 SAD組血清BDNF水平(17.21±3.15)ng/ml明顯比對照組(21.85±5.42)ng/ml低(U=5.408 5，P<0.001)；在SAD組中，AA基因型的患者血清BDNF水平(14.32±4.21)ng/ml均比AG基因型患者(17.05±3.53)ng/ml和GG基因型患者(19.42±3.36)ng/ml低(F=7.254 5，P=0.001 6)，提示了基因的表達影響了BDNF的表達。

表1 BDNF基因的功能性多態(tài)(rs6265)等位基因及基因型在SAD和正常者中的分布比較〔n(%)〕

3 討 論

BDNF作為神經營養(yǎng)因子中的一個重要成員,在中樞神經系統(tǒng)(CNS) 廣泛地表達,但主要存在于海馬、皮質和紋狀體中，可保護神經元對抗神經毒性物質、局部缺血和氧化等各種損傷,防止內源或外源因素導致的細胞凋亡。在體內,BDNF與神經元存活、增殖、軸突生長、突觸可塑性以及學習和記憶等有密切的關系〔4，5〕。如果海馬內BDNF基因的缺失，可導致大鼠記憶和空間知覺能力的損害〔6〕。和正常海馬相比，SAD 患者海馬、顳葉皮層、內皮層及齒狀回中BDNF表達明顯降低〔7，8〕。本研究說明了SAD患者中，AD與 BDNF rs6265多態(tài)性相關，提示了BDNF表達水平及隨后的蛋白水平的改變可能參與了SAD 的早期病理過程。

遺傳多態(tài)性廣泛存在于基因組中，對于研究個體的表型差異、不同群體和個體對疾病的易感性、對各種藥物的耐受性以及對環(huán)境因素的反應性等具有重要的意義。單核苷酸多態(tài)性是人類基因組中最常見的一種遺傳多態(tài)，因此被廣泛應用于疾病易感基因的定位及連鎖和關聯(lián)分析。rs6265是位于BDNF基因的編碼外顯子，是目前已知的BDNF基因的功能性多態(tài),其G/A多態(tài)導致第66位氨基酸密碼子的改變,使編碼氨基酸發(fā)生Val-Met(擷氨酸-蛋氨酸)的轉換,并影響B(tài)DNF的分泌〔9〕。有報道，大鼠大腦皮層及海馬和血清BDNF水平有相似的變化，且血清BDNF與皮質 BDNF 的水平呈正相關〔10〕。對AD患者BDNF表達的進一步研究顯示，AA、AG及GG3種基因型中，AA基因型的患者的血清BDNF水平最低，提示了AA基因型能降低BDNF的表達，與Ventriglia等〔11，12〕報道的攜帶 A/A基因型者患AD 的危險性比攜帶G等位基因者明顯增高的結論相似。由于BDNF通過刺激生長激素抑制素的表達，從而增加β-淀粉樣蛋白的降解〔13〕，因此，AD患者的BDNF水平下降，β-淀粉樣蛋白的降解速度減慢，從而導致β-淀粉樣蛋白的沉積。而β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積在AD的發(fā)病中起重要作用，胞外Aβ的增加和沉積是神經原纖維纏結、神經元功能喪失和神經元死亡的始動環(huán)節(jié)，也就是AD發(fā)生的起始〔14〕。

綜上，BDNF基因的功能性多態(tài)-rs6265降低了BDNF的表達，引起了SAD的早期病理過程。

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