田小磊 王 坤 靳安民

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510282)

脊髓損傷(SCI)可造成患者功能障礙并留下終生殘疾，目前關(guān)于SCI的治療和愈合護(hù)理尚存在爭(zhēng)議，故對(duì)于如何最大限度降低患者殘疾程度，恢復(fù)其脊髓功能在醫(yī)學(xué)界成為研究熱點(diǎn)〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)，SCI不但能造成細(xì)胞壞死，同時(shí)能造成細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象，從而影響脊髓的相關(guān)功能〔3〕。過(guò)去認(rèn)為細(xì)胞凋亡的主要途徑為線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑〔4〕，如今在一些研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)也能造成細(xì)胞凋亡，其中轉(zhuǎn)錄因子(C/EBP)家族中的CHOP/GADD153是特異的ERS轉(zhuǎn)錄因子〔5〕。本研究通過(guò)觀察大鼠急性SCI前后其脊髓組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(CHOP)的表達(dá)情況以及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡變化，從而進(jìn)一步探討ERS激對(duì)于急性SCI的意義。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取56只6～8周齡健康 SD 大鼠 (湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供)，雌雄各半，體重 320～400 g。隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組28只，按損傷時(shí)間點(diǎn)將每組分為3、24 h、3、7 d四組(每組7只)，每組均在脊髓損傷后計(jì)算時(shí)間，并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能Tarlov評(píng)分，而后處死動(dòng)物進(jìn)行心臟灌注和組織觀測(cè)試驗(yàn)。

1.2建立動(dòng)物模型 以Allen法作為參照制作脊髓損傷大鼠模型。實(shí)驗(yàn)組制作方法：(1)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/kg)麻醉大鼠后，固定大鼠四肢及門(mén)牙于解剖板上；(2)剪凈大鼠胸背部T10處及其周?chē)? cm2面積的毛，使其皮膚組織暴露；(3)用3%絡(luò)合碘進(jìn)行皮膚消毒，在T10水平背部正中線(xiàn)做2～3 cm縱行切口，依次切開(kāi)皮膚、筋膜，并可見(jiàn)白色腱膜；(4)剝離棘突兩側(cè)的肌肉暴露T9～T11棘突和椎板；(5)切除T9、T10椎板，暴露硬膜囊范圍約1.0×0.4 cm2大??；(6)用10 g質(zhì)量的條形金屬撞擊器控制2.5 cm高度在導(dǎo)向器內(nèi)做自由落體打擊導(dǎo)向器底部，導(dǎo)向器嘴部撞擊硬膜囊致脊髓中度損傷，若大鼠尾巴和后肢發(fā)生抽搐，則急性SCI大鼠模型制作成功；(7)逐層關(guān)閉切口，以敷料覆蓋傷口并固定，單籠飼養(yǎng)；(8)每天每只大鼠以青霉素和慶大霉素聯(lián)合抗感染，生存時(shí)間長(zhǎng)于3 d者共給藥3 d，并輔以人工排尿、排便及清理傷口等處理。 對(duì)照組的大鼠只做T9、T10椎板切除術(shù)，不進(jìn)行脊髓撞擊，其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3評(píng)定神經(jīng)功能 分別于術(shù)后3、24 h、3、7 d觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)情況，參照改良 Tarlov 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：0分，后肢無(wú)主動(dòng)活動(dòng)；1分，后肢可小范圍活動(dòng)，無(wú)行走能力；2分，后肢活動(dòng)頻繁或有力、無(wú)行走能力；3分，可行走，步態(tài)嚴(yán)重障礙；4 分，可行走，步態(tài)輕度障礙；5分，可正常行走。

1.4心臟灌注和組織觀測(cè) (1)心臟灌注：①分別在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各取7只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/kg) 麻醉大鼠后固定于解剖板，打開(kāi)大3鼠胸腔暴露心臟；②用止血鉗牽拉，將7號(hào)半輸液器針頭插入大鼠左心房直至主動(dòng)脈內(nèi)，剪開(kāi)右心耳；③將生理鹽水100 ml快速灌注大鼠心臟，控制流速確保血管不鼓破；④用4%多聚甲醛快速灌注約15 min后，控制滴速(20 滴/min)再灌注3 h。(2)組織提?。孩僖訲8～T10為中心，取2 cm左右的損傷節(jié)段脊柱，仔細(xì)咬去椎板、椎體和周?chē)：劢M織，剝離除完整的脊髓組織；②將磷酸緩沖液清洗脊髓組織，于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定保存。 (3)組織學(xué)觀察：①用石蠟常規(guī)包埋，于損傷中心部位連續(xù)切片5張，5 μm厚；②隨機(jī)抽取2張切片均進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色；③采用HPIAS-1000圖像分析系統(tǒng)，于高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，測(cè)定累積光密度IOD，取其平均值。

1.5缺口原位末端標(biāo)記法(TUNEL) 染色 隨機(jī)抽取1張脊髓損傷組織切片進(jìn)行TUNEL染色。染色方法：(1)將切片脫蠟入水，在室溫下用3%H2O2處理10 min，0.01 mol/L磷酸緩沖液清洗1次，在溫度37℃下用1∶200 蛋白酶 K消化10 min，于200 ml 0.1 mol 檸檬酸鈉的濕盒中放置切片；(2)用微波修復(fù)5 min，0.01 mol/L磷酸緩沖液清洗2次；(3)在切片中滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)及標(biāo)記液(TUNEL 試劑盒來(lái)自Roche公司 )；(4)在熒光顯微鏡激發(fā)強(qiáng)度為450～500 nm下觀察其熒光表達(dá)(綠光，波長(zhǎng)為515～565 nm)；(5)在40倍鏡下采集圖像，若發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明為陽(yáng)性細(xì)胞，且每張切片選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，可用平均光密度描述細(xì)胞凋亡的情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，7 d時(shí)點(diǎn)組進(jìn)行兩因素重復(fù)測(cè)量分析；實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行單因素方差分析；CHOP 表達(dá)和細(xì)胞凋亡資料進(jìn)行兩因素析因方差分析；重復(fù)測(cè)量分析中的精細(xì)多次比較，按Bonferroni校正法進(jìn)行顯著性水平α’的調(diào)整。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能改良Tarlov評(píng)分 術(shù)后實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)了不同程度的后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙，而對(duì)照組各大鼠均未見(jiàn)明顯運(yùn)動(dòng)功能損害。見(jiàn)表1。整體分析發(fā)現(xiàn)：兩組4時(shí)點(diǎn)間，組別與時(shí)間的交互作用等均有顯著性意義(P<0.05)。再進(jìn)行精細(xì)比較，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩組間的差異均顯著(P<0.05)；經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，僅實(shí)驗(yàn)組的3 d和3 h兩時(shí)點(diǎn)比較有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，其他時(shí)點(diǎn)間比較均不顯著。實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙在3 d時(shí)最明顯，另外各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組大鼠改良Tarlov評(píng)分均高于實(shí)驗(yàn)組，且實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組改良Tarlov評(píng)分差別均較大。

表1 7 d時(shí)點(diǎn)組大鼠急性SCI后不同時(shí)間點(diǎn)改良Tarlov評(píng)分±s,n=7)

考慮到Tarlov評(píng)分觀測(cè)，都是在大鼠被處殺前，4個(gè)時(shí)間組分別進(jìn)行了1～4次評(píng)分觀測(cè)，這些多次評(píng)分尤其是實(shí)驗(yàn)組的多次評(píng)分，都攜有不可忽略的試驗(yàn)信息，此數(shù)據(jù)的重復(fù)測(cè)量性質(zhì)已被弱化，故按4個(gè)時(shí)間獨(dú)立組進(jìn)行分析(單因素方差分析)。3 h：3.82±0.51,1 :3.37±0.54,3 d：2.32±0.62,7 d:3.43±0.50。分析結(jié)果為：整體分析為顯著性差異(P<0.05)，兩兩比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2組織學(xué)檢查 對(duì)照組大鼠急性SCI組織切片中未見(jiàn)明顯壞死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)組當(dāng)時(shí)間在3 h時(shí)大鼠脊髓組織主要以壞死細(xì)胞為主，并出現(xiàn)血腫、脂肪液化、細(xì)胞核碎裂、細(xì)胞溶解現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)間在1 d 時(shí)出現(xiàn)較明顯凋亡細(xì)胞，并伴有神經(jīng)細(xì)胞固縮以及凋亡小體，3 d時(shí)凋亡細(xì)胞更多，但7 d時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)則有所降低。

2.3CHOP 表達(dá)情況 整體比較：兩個(gè)組間，4個(gè)時(shí)點(diǎn)間，分組及時(shí)間的交互作用均顯著(P<0.05)，提示CHOP水平兩組不同，4個(gè)時(shí)點(diǎn)間不同，各組隨時(shí)間的變化情況不同。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠急性SCI后不同時(shí)間點(diǎn)CHOP(累積光密度)表達(dá)±s,n=7)

結(jié)合數(shù)據(jù)來(lái)看：對(duì)照組大鼠急性SCI組織切片中免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)不明顯。實(shí)驗(yàn)組在3 h后就有CHOP表達(dá)，SCI后1 d時(shí)CHOP表達(dá)雖有所升高，但與3 h相比差別不大；SCI 3 d時(shí)CHOP表達(dá)達(dá)到高峰，7 d時(shí)又有所下降，且SCI 1 d和7 d時(shí)CHOP的表達(dá)均與3 d時(shí)差別明顯。另外，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組CHOP表達(dá)與對(duì)照組均有較大差別。

2.4細(xì)胞凋亡情況 分析結(jié)果顯示：整體比較，兩個(gè)組間，4個(gè)時(shí)點(diǎn)間，分組及時(shí)間的交互作用差異顯著(P<0.05)，提示CHOP水平兩組不同，4個(gè)時(shí)點(diǎn)間不同，各組隨時(shí)間的變化情況不同。見(jiàn)表3。

結(jié)合數(shù)據(jù)來(lái)看：實(shí)驗(yàn)組3 h時(shí)細(xì)胞凋亡情況與對(duì)照組差別不明顯，而1 d、3 d、7 d時(shí)兩組細(xì)胞凋亡均具有較大差別；實(shí)驗(yàn)組3 h和1 d之間、1 d和3 d之間，3 d和7 d之間細(xì)胞凋亡均差別較大，其中3 d時(shí)細(xì)胞凋亡最為明顯。

表3 各組大鼠急性SCI后不同時(shí)間點(diǎn)TUNEL(平均光密度)表達(dá)±s,n=7)

2.5CHOP 表達(dá)與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性 CHOP表達(dá)與細(xì)胞凋亡情況，在時(shí)間上兩者的趨勢(shì)表現(xiàn)相似，均于SCI 3 d后達(dá)到高峰。兩組相關(guān)分析得到 Pearson相關(guān)系數(shù)為0.729，且P=0.040，說(shuō)明CHOP的表達(dá)與細(xì)胞凋亡具有直線(xiàn)相關(guān)。

3 討 論

SCI因能夠使患者發(fā)生功能障礙并造成終生殘疾，嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量，降低了勞動(dòng)生產(chǎn)率，增加了家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)〔6〕。一般情況下，SCI可以分為原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI。原發(fā)性SCI是由于機(jī)械性外力造成脊髓組織被破壞造成出血、壞死等損傷，而繼發(fā)性SCI是在原發(fā)性SCI后，由于組織損傷部位及附近部位發(fā)生缺血再灌注損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)損傷、產(chǎn)生炎癥介質(zhì)、發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡等一系列生理病理變化而造成的SCI〔7〕。SCI的最終結(jié)局不僅與原發(fā)性損傷有關(guān)，同時(shí)還跟繼發(fā)性損傷有直接聯(lián)系。關(guān)于繼發(fā)性損傷的機(jī)制目前尚不明確，一直是醫(yī)學(xué)研究中的難題，通過(guò)物理或藥物等人工干預(yù)方法進(jìn)行治療和護(hù)理，對(duì)于患者功能障礙的恢復(fù)及提高其生活自理能力具有重要意義〔8〕。

細(xì)胞凋亡是在病理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡，目前有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡能?chē)?yán)重影響SCI后的神經(jīng)功能，是造成脊髓發(fā)生繼發(fā)性損傷的主要因素〔3〕。過(guò)去認(rèn)為細(xì)胞凋亡的主要有兩種途徑即線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑，如今在一些研究中發(fā)現(xiàn)，ERS也能造成細(xì)胞凋亡〔9〕，其中轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族中的CHOP/GADD153是特異的ERS轉(zhuǎn)錄因子〔10〕。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中非常重要的一種細(xì)胞器，包括鈣離子的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的加工合成等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中具有多種酶，且能對(duì)機(jī)體狀態(tài)進(jìn)行即時(shí)監(jiān)控，當(dāng)各種生理病理原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生變化時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將進(jìn)行對(duì)應(yīng)應(yīng)答反應(yīng)即ERS反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的主要標(biāo)志是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、GRP94和協(xié)調(diào)因子153(GADD153)。當(dāng)GRP78和GADD153表達(dá)升高說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了ERTS〔11〕。若應(yīng)激強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)及時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于病態(tài)狀態(tài)導(dǎo)致其功能難以修復(fù)，從而能促使C反應(yīng)蛋白(CRPs)、蛋白質(zhì)折疊酶以及鈣網(wǎng)蛋白等物質(zhì)形成增加以增強(qiáng)細(xì)胞的耐受能力〔12〕。若存在持續(xù)嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，機(jī)體能使一些促凋亡因子如caspase-12、CHOP/GADD153表達(dá)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑，從而造成細(xì)胞的凋亡和組織的損傷。

綜上所述，急性SCI早期主要表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，后期細(xì)胞凋亡數(shù)增多。急性SCI能促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激，同時(shí)能夠增加促凋亡因子CHOP的表達(dá)。CHOP表達(dá)水平早期時(shí)比較低，3 d時(shí)CHOP表達(dá)水平明顯升高，引起細(xì)胞凋亡數(shù)也增多，CHOP表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡具有直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系。

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