柳 春 楊雪峰 張瑞鵬 趙丹玉 王艷杰

(遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧 沈陽 110032)

血管并發(fā)癥是致2型糖尿病患者死亡的主要原因，而高頻率的內皮細胞凋亡是血管病變發(fā)生的第一步〔1〕。苦蕎麥總黃酮主要存在于苦蕎麥花、葉、莖、籽粒中，具有抗氧化、抗衰老、改善血管微循環(huán)的作用〔2〕。軟脂酸(PA)可致內皮細胞凋亡。本實驗通過觀察苦蕎麥總黃酮對軟脂酸誘導人臍靜脈內皮細胞株(EA.hy926)凋亡模型的影響，探討其抑制細胞凋亡的保護機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人臍靜脈內皮細胞EA.hy926購自中國科學院上海細胞庫，體外培養(yǎng)傳代。DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司；PA、二甲基亞砜購自Sigma公司、0.25%胰蛋白酶購自北京鼎國公司；RT-PCR 試劑盒、Trizol、瓊脂糖購自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2抗體、羊抗兔IgG、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組 細胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基置于37℃，5% 二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng),每2～3天換液，細胞長至亞融合后,用0.25%胰酶消化傳代，實驗用第3～4代細胞。細胞分為對照組(50 ng/L胰島素),模型組(50 ng/L胰島素+600 mmol/L PA)，苦蕎麥總黃酮組(50 ng/L胰島素+600 mmol/L PA+125 μg/ml)和二甲雙胍組 (50 ng/L胰島素+600 mmol/L PA+2 mmol/L二甲雙胍) 。

1.2.2RT-PCR法檢測Bcl-2 mRNA表達 Trizol法提取總RNA并測定其含量。RT-PCR法對Bcl-2進行擴增，以β-actin 為內參。人β-actin 引物:上游引物：AggAgC AATgATCTTgATCTTCA-3′，下游引物:5′-ATCATgAAgTgTACgTggACAT-3′(擴增長度153 bp)。Bcl-2引物：上游引物：5′-TgggAgAACAgggTACgATA-3′，下游引物： 5′-CCACCgAACTCAAAgAAgg-3′(擴增長度453 bp)。Bcl-2 退火溫度為56℃，β-actin 的退火溫度為65℃。取擴增產(chǎn)物5 μl,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行對電泳結果進行分析，結果用Bcl-2 條帶光密度值與內參β-actin條帶光密度值的比值表示。

1.2.3免疫組織化學法檢測Bcl-2 蛋白表達 采用免疫組化SABC法測定EA.hy926細胞Bcl-2 蛋白的表達。各組細胞處理后用多聚甲醛固定,PBS沖洗3遍，加0.5%的TritonX100 20 min,再次用PBS沖洗3遍，加0.3% 過氧化氫(H2O2)15 min。5%BSA封閉20 min，滴加兔抗人Bcl-2 抗體4℃過夜。用HRP標記的羊抗兔IgG 37℃ 20 min。PBS沖洗3遍，DAB法顯色。陰性對照：一抗用PBS代替，其余條件相同。

2 結 果

2.1苦蕎麥總黃酮對PA刺激后EA.hy926 細胞Bcl-2 mRNA 表達的影響 模型組中Bcl-2 mRNA 表達水平明顯降低,與對照組有顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，苦蕎麥總黃酮組與苦蕎麥總黃酮組Bcl-2 mRNA 表達顯著增加(P<0.05)。苦蕎麥總黃酮組與二甲雙胍組之間無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2苦蕎麥總黃酮對PA刺激后EA.hy926 免疫組化結果表明，對照組可見大量Bcl-2陽性表達細胞,且呈強陽性表達；模型組偶見Bcl-2 陽性表達細胞,陽性程度較弱；苦蕎麥總黃酮組和二甲雙胍組可見大量Bcl-2 陽性表達細胞，陽性程度與模型組相比顯著增加。見表1。

表1 苦蕎麥總黃酮對PA刺激后EA.hy926細胞Bcl-2 mRNA及蛋白表達的影響±s,n=6)

3 討 論

血漿游離脂肪酸(FFA)濃度增高是糖尿病血管病變的重要危險因素，而PA是FFA 的主要成分。已證實，高濃度PA 可導致胰島素抵抗，導致2型糖尿病的發(fā)生，并誘導內皮細胞凋亡〔3，4〕。細胞凋亡是為維持內環(huán)境穩(wěn)定，細胞主動的、由基因調控的死亡過程〔5〕。Bcl-2 家族在內皮細胞凋亡的過程中起著至關重要的作用。此家族包括兩類功能相反的蛋白,促凋亡成員如Bax、Bad 等，抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-xl 等。Bcl-2 是一種原癌基因，通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。所以，Bcl-2 表達下調,則抗凋亡能力下降,細胞凋亡增加〔6〕。而內皮細胞過度凋亡則促使血栓形成〔7〕，影響血管重構，從而誘發(fā)糖尿病血管病變。因此,抑制血管內皮細胞的過度凋亡是防治糖尿病血管并發(fā)癥的關鍵。但目前臨床尚缺乏有效藥物。

苦蕎麥味苦，性平、寒，有悠久的入藥歷史?！侗静菥V目》：“降氣寬腸磨積滯 ，消熱腫風痛。”流行病學研究結果表明：苦蕎麥具有降血糖、降血脂和降血壓的作用〔8〕?？嗍w麥總黃酮是苦蕎麥主要化學成分，具有軟化血管、降低毛細血管脆性、改善微循環(huán)、防止血細胞凝集等作用〔9〕，主要包括蘆丁、槲皮素、山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-雙鼠李糖苷等〔10〕。本實驗旨在觀察苦蕎麥總黃酮對PA誘導的內皮細胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)苦蕎麥總黃酮可明顯改善內皮細胞功能障礙，抑制PA所誘導的血管內皮細胞凋亡。本實驗以RT-PCR 技術和免疫組化法檢測各組細胞Bcl-2 mRNA 和蛋白表達水平，結果表明，同對照組相比，模型組細胞Bcl-2 基因和蛋白表達水平顯著降低，說明PA可降低Bcl-2 基因的表達，從而促進內皮細胞凋亡；苦蕎麥總黃酮組和二甲雙胍組細胞同模型組相比，EA.hy926 細胞Bcl-2 mRNA及蛋白明顯升高，說明苦蕎麥總黃酮及二甲雙胍可促進Bcl-2 mRNA和蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡,提升EA.hy926細胞的增殖能力。苦蕎麥總黃酮組與二甲雙胍組相比，Bcl-2基因及蛋白的表達無明顯差異，作用相當。但是二甲雙胍毒副作用較強，不適于長期使用。

本研究證實，苦蕎麥總黃酮能促進Bcl-2 基因的表達，抑制內皮細胞凋亡。因此，苦蕎麥總黃酮有利于血管內皮的修復及新生血管的形成，對2型糖尿病血管并發(fā)癥的防治有十分重要的意義。

4 參考文獻

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