王 林 張秀艷 石國(guó)剛 于錦萍 陳 紅 房 芳

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院分院藥劑科，河北 唐山 063000)

胰腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移是胰腺癌手術(shù)切除治療的難點(diǎn)。有報(bào)道胰腺癌組織中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的陽(yáng)性率接近50%，并參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。本文擬觀察厄洛替尼對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲的影響及核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1材料 人胰腺癌細(xì)胞株(PANC-1)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于美國(guó)Sigma aldrich公司RAD001用二甲基亞砜(DMSO)配制成1 mmol/L貯備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)處理組、厄洛替尼處理組、EGF聯(lián)合厄洛替尼處理組。EGF、厄洛替尼作用濃度分別為10 ng/ml、4 μmol/L。聯(lián)合組為EGF先作用24 h后再加厄洛替尼作用4 h。

1.2方法 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化。調(diào)節(jié)PANC-1細(xì)胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 ml DMSO，振蕩10 min，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度(OD)值，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率，抑制率=〔(空白對(duì)照組OD值-各實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照組OD值〕× 100%。

Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)：分別收集各處理組的PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于8 μm孔徑的Transwell板(購(gòu)自Nunc公司)，于半透膜上層加入2×105PANC-1細(xì)胞系。4 h后于顯微鏡以不同高倍視野(5個(gè)高倍視野)下計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野平均細(xì)胞數(shù)。

Western印跡檢測(cè)NF-κB的p65蛋白水平的表達(dá)。收集各組細(xì)胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測(cè)定濃度后-80℃保存?zhèn)溆?。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的Tris鹽酸緩沖液(TBST)，4℃過(guò)夜，洗膜，然后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)1 h，目標(biāo)蛋白質(zhì)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。計(jì)算機(jī)掃描，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白做參照。

2 結(jié) 果

厄洛替尼對(duì)人PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，并且具有劑量依賴性(P<0.05)。EFG促進(jìn)PANC-1細(xì)胞侵襲，厄洛替尼作用于PANC-1胰腺癌細(xì)胞上清液條件培養(yǎng)基可顯著抑制PANC-1細(xì)胞的侵襲(P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，厄洛替尼作用48 h后可以顯著抑制胰腺癌PANC-1 細(xì)胞分泌NF-κB，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 厄洛替尼抑制PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)(%)

3 討 論

盡管手術(shù)是惟一有望治愈胰腺癌的方法，但胰腺癌早期很難發(fā)現(xiàn)，臨床上的診斷病例大多為晚期，僅10%～20%的患者具有手術(shù)根治切除的機(jī)會(huì)〔1〕。侵襲和轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者死亡的主要原因。已有學(xué)者證實(shí)EGF及其受體在這一過(guò)程中起重要作用〔2〕。厄洛替尼為人表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，主要通過(guò)與三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶功能域，抑制受體自磷酸化而阻止下游信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤作用〔3〕。本文結(jié)果表明，厄洛替尼可以抑制胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

NF-κB是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)因子，由P50和P65組成的二聚體，調(diào)節(jié)許多與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化相關(guān)的基因表達(dá)〔4〕。胰腺癌組織有較高的NF-κB活性和表達(dá)，對(duì)于胰腺癌的發(fā)展起著一定的推波助瀾作用。同時(shí)，有研究證實(shí)使用NF-κB抑制劑可以阻斷NF-κB P65的表達(dá)及NF-κB的DNA結(jié)合活性〔5〕。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用厄洛替尼處理后的胰腺癌PANC-1 細(xì)胞增殖明顯受到抑制，并且能夠明顯下調(diào)NF-κB的活性。因此，厄洛替尼通過(guò)抑制EFG介導(dǎo)的NF-κB的活化，發(fā)揮其抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Tang ZY，Wu YL，Gao SL，etal.Effects of the proteasome inhibitor bortezomib on gene expression profiles of pancreatic cancer cells〔J〕.J Surg Res，2008；145(1)：111-23.

2張 浩，劉小芳，劉昱翼，等.EFG介導(dǎo)的NF-κB促進(jìn)體外胰腺癌細(xì)胞的uPA表達(dá)與侵襲力〔J〕.中華腫瘤雜志,2007；29(12)：909-12.

3Vaira V,Lee CW,Goel HL,etal. Regulation of survivin expression by IGF-1 /mTOR signaling〔J〕.Oncogene，2007;26(19)2678-84.

4Egan LJ,Toruner M.NF-κB signaling pros and cons of the ring NF-κB as a therapeutic approach.〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2006;1072(1)：114-22.

5程卓鑫,孫 備,王雙佳,等.核因子κB在缺氧微環(huán)境中對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華外科雜志,2012;50(5):446-51.