白 軍，寧映霞，陳硯芬，賀韓臻，鄭喆文

(1.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東深圳518172；2.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510120；3.武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦產(chǎn)科，湖北武漢430000)

黃荊(VitexnegundoL)為被子植物馬鞭草科的牡荊屬植物，分布于我國20余省，以秦巴山區(qū)資源最為豐富，黃荊果實(子)、葉、枝及根均可入藥，其味苦，性溫，具有清熱解表，得濕解毒、止咳平喘作用，主治咳嗽、哮喘、風濕、腫痛等[1]。黃荊子為黃荊的果實，目前，對黃荊的研究主要集中在黃荊子的化學提取物上，如黃酮類、二萜類等化合物。黃荊子乙酸乙酯提取物(the extract from semenviticis negundo with acetoactate,EVn-50)是從黃荊子中提取的黃酮類化合物，有研究報道EVn-50在體外抗腫瘤的效用[2]，但是其傳統(tǒng)的抗炎作用尚未見報道，故本研究建立常見的幾種急性炎癥模型，分別施以不同濃度的EVn-50，探討其體內(nèi)抗炎效果及其可能的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EVn-50購自北京中醫(yī)藥大學，地塞米松(恒瑞醫(yī)藥)，二甲苯、0.7%醋酸、去甲斑蝥素(北京第三制藥廠)，兔抗p38MAPK(Beyotime公司)，GAPDH(Abzoom公司)，ELISA酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Beyotime公司)；健康成年雄性SD大鼠50只，體重225-250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)公司提供(合格證：0093102，許可證：SCXK(京)2012-0011)；ICR小鼠50只，體重18-24 g(由北京維通利華實驗動物技術(shù)公司提供(合格證：0093109，許可證：SCXK(京)2012-0001)，于無菌屏蔽環(huán)境(百級無菌室)中飼養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型實驗 ICR小鼠隨機分成5組，每組5只，即5、10、20 mg/kg EVn-50組、1 mg/kg地塞米松(DEX)組和生理鹽水(NS)組。灌胃給藥1 h后，給小鼠右側(cè)耳緣注射30 μg二甲苯，2.5 h后處死小鼠，用直徑為9 mm的打孔機以腫脹中心為圓心切取腫脹耳緣，然后稱取腫脹組織重量，并記錄腫脹程度，計算并比較不同受試藥物對腫脹的抑制率[3]。

1.2.2 雞蛋清致大鼠足跖腫脹模型實驗 SD大鼠隨機分成5組，每組5只，即12.5、25、50 mg/kg EVn-50組、2.5 mg/kg DEX組和NS組。灌胃給藥1 h后，給SD大鼠右側(cè)足跖注射10%新鮮雞蛋清懸液0.05 mL，足跖體積分別在0、0.5、1、2、3、4和6 h被檢測。并記錄腫脹程度，計算并比較不同受試藥物對腫脹的抑制率[4]。

1.2.3 腹腔注射0.7%醋酸小鼠腹腔毛細血管通透性增高模型實驗 ICR小鼠隨機分成5組，每組5只，即5、10、20 mg/kg EVn-50組、1 mg/kg DEX組和NS組。灌胃給藥1 h后，經(jīng)小鼠尾部靜脈注射10 ml/kg生理鹽水稀釋的依文思藍溶液。然后每只小鼠腹腔注射0.7%的醋酸溶液0.2 mL，30 min后，處死小鼠，打開腹腔，收集腹腔溶液，并用10 mL的生理鹽水沖洗腹腔，離心腹腔收集液，去除污染物，溶液采用比色法用分光光度計在590mm波長進行檢測，血管通透效應用吸光度(A)來表達，它代表依文思藍染液總的腹腔滲出量。計算并比較不同受試藥物對腹腔毛細血管通透性的抑制率[5]。

1.2.4 腹腔注射去甲斑蝥素對大鼠全身性炎癥模型實驗 SD大鼠隨機分成5組，每組5只，即50、100、200 mg/kg EVn-50組、5 mg/kg DEX組和NS組。灌胃給藥1 h后，每只大鼠腹腔注射15 mg/kg的去甲斑蝥素溶液0.2 mL，24 h后，心臟穿刺缺血并處死大鼠，檢測血液白細胞數(shù)值和C反應蛋白[6]。

1.2.5 Westernblot印跡檢測全身性炎癥大鼠模型血白細胞p38MAPK蛋白表達情況 處死腹腔注射去甲斑蝥素誘導的大鼠全身性炎癥模型大鼠，收集血液，離心提取炎性大鼠白細胞，加入細胞裂解液，提取白細胞蛋白，取30 μg定量蛋白SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用5%脫脂牛奶-TBST室溫搖床封閉2 h，于37℃下孵育一抗和二抗，ECL發(fā)光劑激發(fā)熒光，壓片顯影定影[7]。結(jié)果用灰度掃描儀處理分析，以上實驗重復3次。

1.2.6 ELISA方法檢測全身性炎癥大鼠模型血清中TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2的水平 處死腹腔注射去甲斑蝥素誘導的大鼠全身性炎癥模型大鼠，收集血液。用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，在微孔板中依次加入標本或標準品生物素化的抗TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2抗體，HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2的濃度呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計算抗炎因子濃度，測定血清中TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2的含量[8]。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 EVn-50對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制作用

口服EVn-50可以顯著抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹，5、10、20 mg/kg的EVn-50對二甲苯致小鼠耳廓腫脹抑制率分別為20.6%、26.3%和32.5%，與NS對照組比較，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而DEX組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹抑制率為28.2%，與10 mg/kg組的EVn-50相當，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 EVn-50對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制效果

2.2 EVn-50對雞蛋清致大鼠足跖腫脹抑制作用

口服EVn-50可以顯著抑制雞蛋清致大鼠足跖腫脹，50 mg/kg的EVn-50對雞蛋清致大鼠足跖腫脹抑制作用發(fā)生在3、4、6 h，與NS對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；25 mg/kg的EVn-50對雞蛋清致大鼠足跖腫脹抑制作用發(fā)生在4、6 h，與NS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在0.5、1和2 h內(nèi)，與NS組比較，25 mg/kg和50 mg/kg的EVn-50對雞蛋清致大鼠足跖腫脹抑制率均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NS組比較，12.5 mg/kg的EVn-50對雞蛋清致大鼠足跖腫脹抑制作用率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而2.5 mg/kg DEX組對雞蛋清致大鼠足跖腫脹抑制作用從0.5h開始就很明顯，與NS組比較，各時間段均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 EVn-50對雞蛋清致大鼠足跖腫脹抑制效果

2.3 EVn-50對腹腔注射07%醋酸小鼠腹腔毛細血管通透性抑制作用

口服EVn-50可以顯著抑制腹腔注射0.7%醋酸引起的小鼠腹腔毛細血管通透性，5、10、20 mg/kg的EVn-50對腹腔注射0.7%醋酸后，小鼠腹腔依文思藍染液滲出抑制率分別為24.0%、35.8%和45.5%，與NS對照組比較，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而DEX組對腹腔注射0.7%醋酸小鼠腹腔毛細血管通透性抑制率為43.8%，與10 mg/kg組的EVn-50相當，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 EVn-50對腹腔注射07%醋酸小鼠腹腔毛細血管通透性抑制效果

2.4 EVn-50對腹腔注射去甲斑蝥素誘導的全身性炎癥大鼠模型的作用

口服EVn-50可以顯著下調(diào)腹腔注射去甲斑蝥素誘導全身炎性大鼠血液炎性細胞的表達。50、100、200 mg/kg的EVn-50對大鼠血液白細胞總數(shù)(WBC)、中性粒細胞比率(NEUTP)、淋巴細胞比率(LYMPHP)和CRP的下調(diào)率與NS對照組比較，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而DEX組對腹腔注射去甲斑蝥素誘導全身炎性大鼠血液WBC、NEUTP和CRP表達下調(diào)率與100 mg/kg組的EVn-50相當，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 EVn-50對腹腔注射去甲斑蝥素誘導的全身炎性大鼠模型血液白細胞及CRP的影響

注：與NS組比較，aP<0.05；與DEX組比較，bP<0.05

2.5 EVn-50對腹腔注射去甲斑蝥素誘導的全身性炎癥大鼠模型血液白細胞p38MAPK蛋白表達的影響

口服EVn-50可以顯著下調(diào)腹腔注射去甲斑蝥素誘導全身性炎性大鼠血液白細胞p38MAPK蛋白表達，50、100、200 mg/kg的EVn-50對大鼠白細胞p38MAPK的下調(diào)率分別為21.0%、36.8%和48.6%，與NS對照組比較，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而DEX組對腹腔注射去甲斑蝥素誘導的全身性炎大鼠血液白細胞p38MAPK蛋白表達下調(diào)率為44.8%，與100 mg/kg組的EVn-50相當，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

2.6 EVn-50對腹腔注射去甲斑蝥素誘導的全身性炎癥大鼠模型血液細胞因子表達的影響

口服EVn-50可以顯著下調(diào)腹腔注射去甲斑蝥素誘導全身炎性大鼠血液胞TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2細胞因子的表達。50、100、200 mg/kg的EVn-50對大鼠血液TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2的下調(diào)率與NS對照組比較，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而地塞米松組對腹腔注射去甲斑蝥素誘導全身炎性大鼠血液TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2表達下調(diào)率與100 mg/kg組的EVn-50相當，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

圖4 EVn-50對腹腔注射07%醋酸小鼠腹腔

GroupsTNF-αIL-1IL-6COX-2NS136.28±19.211150.02±20.24104.28±21.93210.23±39.48100mg/kg DEX59.24±12.82a490.18±109.07a68.54±12.42a40.23±11.56a50 mg/kg EVn-5080.56±27.93ab890.16±152.24ab97.59±33.58ab156.45±28.67ab100 mg/kg EVn-5063.46±23.12a520.23±64.86a73.36±33.27a83.45±12.73a200 mg/kg EVn-5050.26±21.05ab340.86±25.45ab62.54±30.41ab28.56±4.68ab

注：與NS組比較，aP<0.05；與DEX組比較，bP<0.05

3 討論

黃荊子為馬鞭草科牡荊屬植物黃荊(VitexnegundoL)的干燥成熟果實，其性溫，味辛、苦；歸肺、胃、肝經(jīng)；具有祛風解表，止咳平喘，理氣消食止痛的功效，主治傷風感冒，咳嗽，哮喘，胃痛吞酸，消化不良，食積瀉痢，膽囊炎，膽結(jié)石，疝氣[1]；在民間，黃荊子能夠以多種形式包括單方、復方，內(nèi)服煎湯或入丸、散，治療一些炎癥相關的疾病，療效顯著，如哮喘、慢性氣管炎、胃潰瘍和慢性胃炎、腸炎；在臨床上，黃荊子焙干研末，煉蜜為丸，可治療慢性氣管炎[2]。現(xiàn)代藥理學研究表明，黃荊子具有多種藥理作用，如鎮(zhèn)咳平喘、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗微生物、保肝以及免疫增強作用等，EVn-50是從黃荊果實中提取的黃酮類化合物，有研究報道EVn-50在體外有抗氧化、抗腫瘤的效用[2]，但是傳統(tǒng)的抗炎作用及其可能的機制尚未見報道，故本研究建立急性炎癥模型，分別施以不同濃度的EVn-50，探討其體內(nèi)抗炎的效果及其可能的分子生物學機制。

MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信號轉(zhuǎn)導通路是真核細胞轉(zhuǎn)導信號到細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，參與細胞的生長、分化以及細胞間相互作用[9]。當細胞受到刺激后，通過某些環(huán)節(jié)使MAPK激酶激酶(MAPKKK)活化，活化的MAPKKK激活MAPK激酶(MAPKK)，后者通過雙位點磷酸化激活p38MAPK。MKK3和MKK6是p38MAPK主要的上游激酶[9]。p38MAPK被磷酸化激活后，移位入核，作用于活化轉(zhuǎn)錄因子ATF2、CHOP10等，進而活化選擇素和整合素來招募和活化白細胞，使白細胞粘附于血管壁，進入到周圍組織，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2等炎性細胞因子的表達[10]，而炎性細胞因子則參與體內(nèi)具體的炎癥反應的發(fā)生發(fā)展。p38MAPK特異性抑制劑SB203580可通過抑制p38MAPK酶活性，減少或阻斷多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應。MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有積極的意義，有望成為炎癥治療的的一個新的靶點[11]。

本研究提示，EVn-50可以顯著改善二甲苯致ICR小鼠耳廓急性炎性腫脹癥狀，雞蛋清致SD大鼠足跖急性炎性腫脹癥狀，降低腹腔注射0.7%醋酸致ICR小鼠腹腔毛細血管的通透性，減少去甲斑蝥素誘導的SD大鼠全身性炎癥血液白細胞總數(shù)中中性粒細胞比率和CRP，同時去甲斑蝥素誘導的SD大鼠全身性炎癥血液白細胞p38MAPK蛋白表達降低，去甲斑蝥素誘導的SD大鼠全身性炎癥血液中TNF-α、IL-1、IL-6、COX-2等細胞因子數(shù)量減少。這提示EVn-50可能通過抑制p38MAPK細胞信號轉(zhuǎn)導通路來抑制急性炎癥反應。黃荊子作為祖國傳統(tǒng)中藥，長期應用于抗炎、平喘等治療實踐中，具有安全、可靠、無毒副作用的長期臨床驗證，因此EVn-50有望成為一種新的理想的抗炎藥物，具有廣闊的開發(fā)前景，但目前EVn-50的抗炎研究還處在實驗階段，相關的機制需進一步探明。

參考文獻：

[1]Chattopadhyay P,Hazarika S,Dhiman S,et al.Vitex negundo inhibits cyclooxygenase-2 inflammatory cytokine-mediated inflammation on carrageenan-induced rat hind paw edema [J]. Pharmacognosy Res,2012,4(3):134-137.

[2]Zhou Y,Liu YE,Cao J,et al.Vitexins,nature-derived lignan compounds,induce apoptosis and suppress tumor growth [J]. Clin Cancer Res,2009,15(16):5161-5169.

[3]Ma Y,Li Y,Li X,et al.Anti-inflammatory effects of 4-methylcyclopentade- canone on edema models in mice[J].Int J Mol Sci,2013,14(12):23980-23992.

[4]Okoye FB,Osadebe PO.A new anti-inflammatory flavonol glycoside from Alchornea floribunda leaves[J].Nat Prod Res,2010,24(3):266- 273.

[5]Koppula S,Kim WJ,Jiang J,et al. Carpesium macrocephalum attenuates lipopolysaccharide-induced inflammation in macrophages by regulating the NF-κB/IκB-α,Akt,and STAT signaling pathways[J].Am J Chin Med,2013,41 (4):927-943.

[6]Massicot F,Dutertre-Catella H,Pham-Huy C,et al.In vitro assessment of renal toxicity and inflammatory events of two protein phosphatase inhibitors cantharidin and nor-cantharidin[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol,2005,96(1):26-32.

[7]Cho MK.Decreased Expression of Type 5 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase (AKR1C3) Protein Identified in Human Diabetic Skin Tissue[J].Ann Dermatol,2013,25(4):423-427.

[8]Abd-Allah SH,Pasha HF,Hagrass HA,et al.Vitamin D status and vitamin D receptor gene polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes in Egyptian children[J]. Gene,2013,(13):1693-1694.

[9]Lombaert IM,Abrams SR,Li L,et al.Combined KIT and FGFR2b Signaling Regulates Epithelial Progenitor Expansion during Organogenesis[J].Stem Cell Reports,2013,1(6):604-619.

[10]Roy R,Parashar V,Chauhan LK,et al.Mechanism of uptake of ZnO nanoparticles and inflammatory responses in macrophages require PI3K mediated MAPKs signaling[J].Toxicol In Vitro,2013,(13):321-324.

[11]Palmieri D,Capponi S,Geroldi A,et al.TNFα induces the expression of genes associated with endothelial dysfunction through p38MAPK-mediated down- regulation of miR-149 [J].Biochem Biophys Res Commun,2014,443(1):246-251.