趙 豐 宋海彬 張 羽 申曉彧

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院心血管內(nèi)科，山西 太原 030001)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定、破裂進(jìn)而形成血栓，是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機(jī)制〔1〕。冠狀動(dòng)脈損傷后啟動(dòng)凝血瀑布反應(yīng)形成血栓，組織因子(TF)參與了此重要過程。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔2〕，氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于巨噬細(xì)胞，大多數(shù)的巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡并表達(dá)TF。瑞舒伐他汀作為新一代HMG-CoA還原酶抑制劑，可明顯下調(diào)低密度脂蛋白、甘油三酯及升高高密度脂蛋白， 氯沙坦是廣泛用于臨床的長效血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)，臨床上兩藥常聯(lián)合使用應(yīng)用于冠心病的二級預(yù)防。兩藥聯(lián)合能否進(jìn)一步降低TF mRNA和蛋白的表達(dá)，國內(nèi)外文獻(xiàn)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦對ox-LDL誘導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞TF mRNA和蛋白表達(dá)的影響并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 健康成人靜脈血來自山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院體檢中心；人淋巴細(xì)胞分離液(Lymphocytes Separation Medium1077)為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；ox-LDL為北京協(xié)生生物科技有限公司產(chǎn)品；佛波酯為美國SIGMA公司產(chǎn)品;FITC-CD14抗體購自日本Beckman Coulter公司；超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(with Rox)、Dnase1 均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TRIzol購自天根生化科技有限公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；瑞舒伐他汀為阿斯利康公司饋贈；氯沙坦為默沙東公司饋贈。

1.2人單核細(xì)胞的分離 取新鮮的健康人靜脈血30 ml，普通肝素抗凝后分到10個(gè)試管中。用RPMI-1640液稀釋1倍后，充分吹打混勻，分別緩慢加入有等比例淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心2 000 r/min，20 min后，吸取中間環(huán)狀云霧狀淋巴細(xì)胞層，再用PBS緩沖液3 ml充分混勻，1 500 r/min離心洗滌2次。取含10%胎牛血清RPMI-1640各5 ml，將試管中的細(xì)胞吹開混勻，然后將細(xì)胞懸液分別加入培養(yǎng)瓶中。于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育，培養(yǎng)至4代后，取指數(shù)生長期細(xì)胞用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.3人單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)與鑒定 向單核細(xì)胞培養(yǎng)基中加入160 nmol/ml的佛波脂無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞后用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，且伸出偽足。臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活率>95%。采用特異熒光素標(biāo)記的CD14細(xì)胞表面抗體行流式細(xì)胞儀鑒定巨噬細(xì)胞。

1.4試驗(yàn)分組 試驗(yàn)共分4個(gè)組。ox-LDL對照組，單核-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中加入ox-LDL 50 μg/ml孵育48 h；瑞舒伐他汀組，ox-LDL 50 μg/ml孵育2 h后，加入瑞舒伐他汀0.1 μmol/L培養(yǎng)48 h；氯沙坦組，ox-LDL50 μg/ml孵育2 h后，加入氯沙坦0.001 mmol/L培養(yǎng)48 h；ox-LDL 50 μg/ml孵育2 h后，加入瑞舒伐他汀0.1 μmol/L聯(lián)合氯沙坦0.001 mmol/L培養(yǎng)48 h。

1.5各組TF mRNA表達(dá)水平檢測 棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入1.0 ml Trizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于30 μl RNase-free 水中。取5 μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定RNA；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在20 μl體系中進(jìn)行：含Primer mix 2 μl、RNA Template 2 μl、RT Mix，5×4 μl，HiFi-MMLV Enzyme Mix 1 μl、RNase-Free 水11 μl。于PCR儀上42℃反應(yīng)1 h，70℃滅活10 min。得到的cDNA可在-20℃保存；TF上游引物序列：5′-CCGACGAGATTGTGAAGGATGTG-3′，下游序列：5′-TTGTT- GGCTGTCCGAGGTTTGT-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，循環(huán)40次。β-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′，下游引物序列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′，產(chǎn)物大小100 bp；結(jié)果分析：反應(yīng)完成后即得Ct值。mRNA表達(dá)相對量用2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct內(nèi)參)處理組-(Ct靶基因-Ct內(nèi)參)未處理組，以ox-LDL組為未處理組。

1.6TF蛋白含量測定 取六孔培養(yǎng)板的上清液進(jìn)行ELISA測定，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每組重復(fù)4次。

2 結(jié) 果

2.1PCR產(chǎn)物的確定分析 TF基因RT-PCR產(chǎn)物的融解曲線峰值為82.5℃。融解曲線無切跡，鋒線銳利，證實(shí)其RT-PCR產(chǎn)物特異性強(qiáng)，無異常擴(kuò)增。

2.2對ox-LDL誘導(dǎo)人單核-巨噬細(xì)胞TF mRNA表達(dá)影響 瑞舒伐他汀組、氯沙坦組與ox-LDL組比較，TF mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦組與瑞舒伐他汀組、氯沙坦組比較，TF mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且二者具有協(xié)同作用。見表1。

2.3對ox-LDL誘導(dǎo)人單核-巨噬細(xì)胞TF蛋白表達(dá)的影響 瑞舒伐他汀組或氯沙坦組與ox-LDL組比較，TF蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦組與瑞舒伐他汀組、氯沙坦組比較，TF蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且二者具有協(xié)同作用。見表1。

表1 各組TF mRNA、TF蛋白表達(dá)水平

3 討 論

ox-LDL引起的內(nèi)皮損傷或激活單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)參與了動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成。ox-LDL是一種強(qiáng)烈的細(xì)胞活化劑，可強(qiáng)有力的促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖，同時(shí)可刺激單核細(xì)胞表達(dá)TF和增強(qiáng)促凝活性。有研究報(bào)道，ox-LDL通過增加TF mRNA及蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致凝血和纖溶的動(dòng)態(tài)失衡，使凝血活性增高，纖溶活性下降〔3〕。

TF是重要的凝血和纖溶調(diào)節(jié)因子，兩者表達(dá)異常時(shí)，正常的凝血和(或)纖溶平衡破壞，易導(dǎo)致血栓形成。Taubman等〔4〕認(rèn)為病變區(qū)TF和纖溶酶原激活物抑制物主要由巨噬細(xì)胞合成，隨著病變的進(jìn)展,TF的量逐漸增加。本研究前期試驗(yàn)表明，ox-LDL可誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞表達(dá)組織因子和增強(qiáng)促凝活性,而且證明這種促凝活性是由TF啟動(dòng)的。培養(yǎng)液中加入瑞舒伐他汀可抑制由ox-LDL誘導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞TF抗原的表達(dá)和促凝活性。

研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物不僅是有效的降血脂藥，同時(shí)還具有不依賴降脂作用的抗血栓和改善血管內(nèi)皮功能的作用〔5〕。體內(nèi)研究證實(shí)〔6，7〕，他汀類可抑制細(xì)胞內(nèi)TF表達(dá)及活性，對凝血和纖溶功能紊亂具有良好的調(diào)節(jié)作用。Markle等〔8〕研究普伐他汀對人血管細(xì)胞凝血和纖溶功能的影響，發(fā)現(xiàn)普伐他汀明顯減少ox-LDL誘導(dǎo)的TF表達(dá)及蛋白產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)凝血和纖溶的動(dòng)態(tài)平衡，減少不穩(wěn)定斑塊處血栓形成。本研究前期實(shí)驗(yàn)表明ox-LDL可能使單核-巨噬細(xì)胞LOX-1受體蛋白、TF蛋白的表達(dá)和分泌增加。而加入瑞舒伐他汀后LOX-1 mRNA和蛋白、TF mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下降，表明瑞舒伐他汀可能通過LOX-1途徑降低TF mRNA。

Nagata等〔9〕研究證明外源性AngⅡ增加體外培養(yǎng)的人單核細(xì)胞的TF mRNA和蛋白表達(dá)。卡托普利和坎地沙坦阻斷單核細(xì)胞內(nèi)源性的腎素血管緊張素系統(tǒng)，可減少單核胞TF mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)減少TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)，說明腎素血管緊張素統(tǒng)與TF的合成有直接聯(lián)系，或者通過TNF-α來調(diào)節(jié)TF的表達(dá)〔10，11〕。Napoleona等〔12〕的研究證明卡托普利、福辛普利、伊普利和洛沙坦減少內(nèi)毒素刺激的單核細(xì)胞的TF活性。他們同時(shí)對作用機(jī)制進(jìn)行了探討，證明卡托利在轉(zhuǎn)錄水平抑制TF的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦TF mRNA表達(dá)下調(diào)更為明顯，其機(jī)制可能，瑞舒伐他汀聯(lián)合氯沙坦可能分別通過阻斷LOX-1表達(dá)和阻斷AT1受體使TF的表達(dá)減少，兩者聯(lián)合加強(qiáng)了這一作用，ELISA的結(jié)果又從蛋白水平證實(shí)了上述關(guān)于TF表達(dá)情況的推論。

綜上，ox-LDL可使人單核-巨噬細(xì)胞TF的表達(dá)增多，降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中繼發(fā)性血栓形成，減少急性冠脈綜合征的發(fā)生，兩者聯(lián)合可通過協(xié)同作用使上述效應(yīng)進(jìn)一步放大。

4 參考文獻(xiàn)

1Libby P，Theroux P.Pathophysiology of coronary artery disease〔J〕.Circulation,2005；111:3487-8.

2Doshi SN,Marmur JD.Evolving role of tissue factor and its pathway inhibitor〔J〕.Crit Care Med，Med，2002；30(5 Supp l):S241-50.

3Cui MZ,Penn SM,Chisolm GM.Native and oxidized low density lipoprotein induction of tissue factor gene expression in smooth muscle cells is mediated by both Egr-1 and Spl〔J〕.J Biol Chem,1999；274:32795-802.

4Taubman MB，F(xiàn)allon JT，Schecter AD,etal.Tissue factor in the pathogenesis of atherosclerosis〔J〕.Thromb Haemost，1997；78(1)：200-4.

5Nissen SE.High-dose statins in acute coronary syndromes not just lipid levels〔J〕.AMA，2004；1292:1365-7.

6Bea F,Blessing E,Shelley MI,etal.Simvastatin inhibits expression of tissue factor inadvanced atherosclerotic lesions of apolipoprotein E defifient of lipid lowering:potential role of simvastatin-mediated inhibition of Egr-1 expression and activation〔J〕.Atherosclerosis,2003；167:187-94.

7Dangas G,Smith DA,Unger AH,etal.Pravastatin:an antitrombotic effect independent of the cholesterol-lowering effect〔J〕.Thromb Haemost,2000；83:688-92.

8Markle RA,Han J,Summers BD,etal.Pitavastatin alters the expression of thrombotic and fibrinolytic proteins in human vascular cells〔J〕.J Cell Biochem,2003；90:23-32.

9Nagata K，Ishibashi T,Sakamoto T,etal.Effects of blockade of the rennin-angiotensin system on tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 synthesis in human cultured monocytes〔J〕.J Hypertens,2001；19:775-83.

10Del Prete G,De Carli M,Lammel RM,etal.Th1 and Th2 T-helper cells exert opposite regulator effects on procoagulant activity and tissue factor production by human monocyte〔J〕.Blood，1995；86:250-7.

11Mulder AB,Hegge-Paping KS,Magielse CP,etal.Tumor necrosis factor alpha-induced endothelial tissue factor is located on the cell surface rather than in the subendothelial matrix〔J〕.Blood,1994；84:1559-66.

12Napoleona E,Di Santo A,Camera M，etal.Angiotensin-converting enzyme inhibitors down regulate tissue faetor synhesis in monocytes〔J〕. Circ Res,2000；86:139-43.