賈國(guó)強(qiáng) 付寶蓮 巴曉紅

(建昌縣人民醫(yī)院，遼寧 建昌 125300)

氯化鋰對(duì)氧糖剝奪的SH-SY5Y細(xì)胞具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，1.0 mmol/L氯化鋰為細(xì)胞保護(hù)的有效劑量，其作用機(jī)制之一可能是對(duì) AIF信號(hào)通路的抑制〔1〕。本實(shí)驗(yàn)擬采用氧糖剝奪的SH-SY5Y細(xì)胞模型模擬腦缺血再灌注損傷進(jìn)一步闡述氯化鋰對(duì)PARP-1/AIF信號(hào)通路的影響，為鋰劑用于缺血性腦血管病的治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要儀器設(shè)備 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱；低溫高速離心機(jī)；BB6220型三氣培養(yǎng)箱；倒置相差顯微鏡；顯微照相系統(tǒng)；超凈工作臺(tái)；BIO-RAD電泳槽；BIO-RAD半干轉(zhuǎn)印儀。

1.2主要試劑 氯化鋰(Sigma)、兔抗人AIF單克隆抗體(abcam)、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(Santa cruz)、兔抗人PARP-1單克隆抗體(Abcam)、小鼠抗人β-actin單抗(Santa cruz)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (Santa cruz)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (Santa cruz)、兔抗組蛋白H1多克隆抗體(Santa cruz)、DMEM培養(yǎng)液(Hyclone)、胎牛血清(Hyclone)、BCA蛋白定量試劑盒及細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(碧云天生物科技公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡(顯色法)檢測(cè)試劑盒(生研生物科技有限公司)。

1.3細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科王占強(qiáng)惠贈(zèng))。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)及氧糖剝奪模型的制備 取一管凍存的SH-SY5Y細(xì)胞，復(fù)蘇，離心，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，傳代。模型制備：更換培養(yǎng)液為無(wú)血清、無(wú)糖人工腦脊液，置入恒溫(37℃)三氣培養(yǎng)箱，連續(xù)充以無(wú)氧氣體(90% N2, 9% CO2和1% O2)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h取出，更換原培養(yǎng)液，在常氧下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.2細(xì)胞分組 取傳代后培養(yǎng)2 d的SH-SY5Y細(xì)胞分為正常對(duì)照組，氧糖剝奪組和鋰劑處理組。正常對(duì)照組細(xì)胞一直置于37℃，5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。氧糖剝奪組更換nACSF，培養(yǎng)30 min后，造模。鋰劑處理組在造模前nACSF中加入1.0 mmol/L的鋰劑進(jìn)行預(yù)處理。

1.4.3TUNEL染色(顯色法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(生研生物科技有限公司)說(shuō)明進(jìn)行操作。每張切片隨機(jī)選400倍下3個(gè)視野,進(jìn)行雙盲觀測(cè),計(jì)算平均陽(yáng)性率作為該標(biāo)本的陽(yáng)性率。

1.4.4Western印跡檢測(cè)PARP-1、AIF蛋白的表達(dá) 取各組細(xì)胞，按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(碧云天生物科技公司)說(shuō)明書(shū)操作，提取胞漿蛋白、胞核蛋白。然后按照BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物科技公司)說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，分別取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(分別為1∶500稀釋的兔抗人AIF單抗、兔抗組蛋白H1單抗、兔抗人PARP-1單抗，小鼠抗人β-actin單抗)，4℃過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(分別為羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG)，室溫孵育 1 h，用DAB顯色。以β-actin與Histone分別作為細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的內(nèi)參照進(jìn)行校正，凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描結(jié)果：測(cè)定蛋白條帶的積分光密度。目的蛋白相對(duì)量=目的蛋白條帶積分光密度/內(nèi)參蛋白條帶積分光密度。

2 結(jié) 果

2.1TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 正常對(duì)照組:有少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(1.80±0.82)。氧糖剝奪組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組明顯增多(16.40±2.30,P<0.05)。鋰劑處理組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較氧糖剝奪組明顯減少(6.52±1.86,P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2Western 印跡檢測(cè)PARP-1、AIF蛋白的表達(dá) SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪前后，胞質(zhì)內(nèi)PARP-1 p85片段沒(méi)有表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)AIF蛋白表達(dá)無(wú)差異。而在胞核中，正常對(duì)照組中PARP-1 p85片段呈低表達(dá)，AIF蛋白低表達(dá)或不表達(dá)，細(xì)胞氧糖剝奪后PARP-1 p85片段、AIF蛋白高表達(dá)，且鋰劑處理組PARP-1 p85片段、AIF條帶的表達(dá)比氧糖剝奪組少，見(jiàn)表1、圖2、圖3。

表1 不同組PARP-1 p85片段、AIF蛋白印跡密度(OD)比較

圖1 不同組細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性表達(dá)(×400)

圖2 各組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白Western印跡表達(dá)

圖3 各組細(xì)胞核內(nèi)蛋白Western印跡表達(dá)

3 討 論

本研究表明氯化鋰對(duì)氧糖剝奪模型的神經(jīng)細(xì)胞有較強(qiáng)的保護(hù)作用。研究表明，這種保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制AIF核移位實(shí)現(xiàn)的〔1〕。但是造成這種核移位的原因可能是通過(guò)激活PARP-1所造成的。

PARP-1是一種核染色質(zhì)伴隨蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)。PARP-1是caspase-3底物之一，caspase-3可將PARP-1裂解為85 kD和24 kD片段，喪失了DNA的修復(fù)作用，故出現(xiàn)PARP-1的裂解片段，被認(rèn)為是發(fā)生細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期標(biāo)志〔2〕。腦缺血后予數(shù)天連續(xù)抑制PARP-1表達(dá)，可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而延長(zhǎng)受損神經(jīng)元細(xì)胞存活并能促進(jìn)神經(jīng)再生〔3〕。AIF的釋放與PARP-1有關(guān)〔4，5〕。Zhang等〔6〕體外實(shí)驗(yàn)得出PARP-1抑制劑可阻止AIF核移位。PARP-1基因敲除同樣可抑制AIF的移位。因此認(rèn)為PARP-1是AIF從線粒體釋放的上游誘導(dǎo)因子。研究發(fā)現(xiàn)PARP-1與AIF依賴的細(xì)胞凋亡可能涉及p53基因、Bax和鈣蛋白酶，但不包括半胱氨酸蛋白酶和PARP-2〔7〕。

AIF定位于線粒體，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)AIF主要反應(yīng)線粒體的AIF的表達(dá)量。而細(xì)胞核內(nèi)的PARP-1 p85片段在各組細(xì)胞中均有表達(dá)，氧糖剝奪前較氧糖剝奪后表達(dá)增強(qiáng)，而鋰劑處理組較氧糖剝奪組表達(dá)減少，說(shuō)明氧糖剝奪激活了PARP-1，而AIF蛋白在正常對(duì)照組中呈低表達(dá)或不表達(dá)，在氧糖剝奪組、鋰劑處理組中呈高表達(dá)，但鋰劑處理組較氧糖剝奪組表達(dá)的明顯減少，說(shuō)明氯化鋰通過(guò)激活PARP-1，從而抑制 AIF從線粒體向細(xì)胞核移位，產(chǎn)生抗凋亡的作用。

但是PARP-1的激活是怎么促使AIF發(fā)生核移位的，至今學(xué)界內(nèi)沒(méi)有明確的解釋。正常情況下，PARP-1起到修復(fù)DNA作用和維持基因組的穩(wěn)定性〔8〕，但如果PARP-1過(guò)度活化可導(dǎo)致ATP和 NAD+不可逆的衰竭〔9〕，線粒體是體內(nèi)產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，大量的ATP消耗，導(dǎo)致線粒體膜通透性發(fā)生改變，AIF從線粒體被釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，啟動(dòng)凋亡的發(fā)生。AIF引起染色體核周邊凝集和DNA成大片段的斷裂〔10〕，造成PARP-1不能及時(shí)的修復(fù)，加重細(xì)胞的損害，惡性循環(huán)，最終細(xì)胞發(fā)生壞死。但現(xiàn)在更多證據(jù)表明單純的能量消耗不足以介導(dǎo)PARP-1依賴性細(xì)胞死亡。在PARP-1敲除小鼠上行缺血性卒中模型研究發(fā)現(xiàn)予維持細(xì)胞內(nèi)能量水平，并不是減小腦梗死體積的機(jī)制。另外，用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，削弱細(xì)胞內(nèi)能量水平不是PARP-1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的主要原因〔11〕。PARP-1過(guò)度激活后，大量的PAR形成對(duì)細(xì)胞有直接毒性作用〔12〕。另外，有可能通過(guò)亞細(xì)胞器等其他的途徑引起的。

綜上，氯化鋰對(duì)氧糖剝奪模型的SH-SY5Y細(xì)胞具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其作用機(jī)制之一可能是通過(guò)抑制PARP-1活性，從而減少AIF發(fā)生核移位。

4 參考文獻(xiàn)

1賈國(guó)強(qiáng), 巴曉紅, 潘鳳英.鋰劑對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪模型的保護(hù)作用及其對(duì)AIF凋亡通路的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011；28(3): 228-32.

2Lazebnik YA, Kaufmann SH, Desnoyers S,etal.Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE〔J〕.Nature, 1994；371(6495): 346-7.

3Kauppinen TM, Suh SW, Berman AE,etal.Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase suppresses inflammation and promotes recovery after ischemic injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2009；29(4): 820-9.

4Yu SW, Andrabi SA, Wang H,etal.Apoptosis-inducing factor mediates poly (ADP-ribose) (PAR) polymer-induced cell death〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 2006；103(48): 18314-9.

5Andrabi SA, Kim NS, Yu SW,etal.Poly(ADP-ribose)(PAR) polymer is a death signal〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 2006；103(48): 18308-13.

6Zhang Y, Zhang X, Park TS,etal.Cerebral endothelial cell apoptosis after ischemia-reperfusion: role of PARP activation and AIF translocation〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab, 2005；25(7): 868-77.

7Moubarak RS, Yuste VJ, Artus C,etal.Sequential activation of poly(ADP-ribose) polymerase 1, calpains, and Bax is essential in apoptosis-inducing factor-mediated programmed necrosis〔J〕.Mol Cell Biol, 2007；27(13): 4844-62.

8Masutani M, Suzuki H, Kamad N,etal.Poly(ADP-ribose) polymerase gene disruption conferred mice resistant to streptozotocin-induced diabetes〔J〕.Proe Natl Aead Sci USA，1999；96(5):2301-4.

9Nguewa PA, Fuertes MA, Valladares B,etal.Poly(ADP-ribose) Polymerases: homology, structural domains and functions.Novel therapeutical applications〔J〕.Prog Biophys Mol Biol，2005；88(1):143-72.

10Yu SW, Andrabi SA, Wang H,etal.Apoptosis-inducing factor mediates poly (ADP-ribose) (PAR) polymer-induced cell death〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 2006；103(48): 18314-9.

11Wang Y, Dawson VL, Dawson TM.Poly(ADP-ribose) signals to mitochondrial AIF: a key event in parthanatos〔J〕.Exp Neurol，2009；218(2): 193-202.

12Szabo G, Bahrle S, Stumpf N,etal.Poly(ADP-Ribose) polymerase inhibition reduces reperfusion injury after heart transplantation〔J〕.Circ Res,2002；90(1): 100-6.