劉煥義 趙 煜 張小龍 徐紅玉 蘇小妹 楊 波

(成都軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科,四川 成都 610083)

在許多植物中都發(fā)現(xiàn)有白藜蘆醇(Res)，其可以抑制癌細(xì)胞生長，有關(guān)Res抑制肺腺癌A549細(xì)胞生長作用的報道較少，對其抗腫瘤的確切機制亦不清楚。本研究擬探討Res誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 低分化肺腺癌A549細(xì)胞由美國Rockville研究所提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清，青-鏈霉素(各100 U/ml)的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃ 、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)。Res購于Sigma公司，用DMSO溶解后保存于-20℃。

1.2Res作用于A549細(xì)胞后形態(tài)學(xué)觀察 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至約80%融合時，分別加入終濃度為25、50、100、200 μmol/L的Res ,同時設(shè)DMSO對照組，作用24 h后在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.34,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)細(xì)胞核熒光染色 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，同步化細(xì)胞24 h后，加藥處理24 h，常規(guī)收集細(xì)胞，棄上清后用80%酒精固定30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，離心，留取少量上清，加入DAPI染色5 min后，再用PBS洗2次，離心去上清，加入適量PBS吹懸，取20 μl滴于載玻片上，中性樹脂封片，熒光顯微鏡觀察。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞懸液調(diào)整為1×105/L接種于96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，去除培養(yǎng)基，再加入含不同濃度(0、25、50、100、200 μmol/L)Res的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個平行孔，同時設(shè)置DMSO對照組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT溶液20 μl,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μl/孔,室溫避光振蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解，于酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處檢測吸光度數(shù)值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗孔OD值/6×對照孔OD值)。

1.5Western 印跡檢測凋亡蛋白變化情況 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次，細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，離心，加入細(xì)胞裂解液〔(10 mmol/L Tris-HCl(pH7.4),150 mmol/L NaCl,0.1%(SDS),100 μg/ml PMSF,0.5%NP-40,0.5%脫氧膽酸鈉〕，4℃冰浴中超聲破碎細(xì)胞，4℃放置待細(xì)胞膜破碎，反復(fù)斡旋后于4℃ 12 000 r/min離心，取上清，蛋白定量后，樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)分離，蛋白電轉(zhuǎn)至聚氧偏乙烯(PVDF)膜。將PVDF膜在10%牛奶中封閉1 h，加入1∶1 000的一抗，4℃溫育過夜，洗滌，加入酶標(biāo)二抗室溫1 h，PVDF膜經(jīng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測特異蛋白。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 Res作用肺腺癌A549細(xì)胞24 h后，在倒置顯微鏡下直接觀察，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞形態(tài)改變，低濃度Res作用時細(xì)胞體積有所增大，但細(xì)胞數(shù)減少；當(dāng)增加Res濃度至200 μmol/L時，大量細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)為細(xì)胞大量漂浮，細(xì)胞間隙明顯增大。見圖1。

圖1 Res作用于A549細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×200)

2.2DAPI細(xì)胞核熒光染色觀察 DAPI是一種DNA特異性染料，與DNA發(fā)生嵌入式結(jié)合，發(fā)出藍(lán)色熒光。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核裂比較明顯，且發(fā)生核邊緣不規(guī)則、核小體核碎片增加。Res可以誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，隨著加入Res濃度增加凋亡越明顯，而對照組細(xì)胞的細(xì)胞核完好無損。見圖2。

2.3MTT檢測Res對肺腺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性 分別給A549細(xì)胞加入不同濃度Res(0、25、50、100、200 μmol/L)后，計算出抑制率分別為0%、12.4%、21.6%、51.3%、89.7%，經(jīng)軟件分析 IC50為 100 μmol/L。

2.4凋亡蛋白的檢測 用0、25、50、100、200 μmol/L Res處理A549細(xì)胞24 h后，P53、Bax、Cleaved-Caspase3表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)量下降，而且Bcl-2/Bax的比值明顯下降。見圖3。

圖2 熒光顯微鏡觀察Res作用24 h后A549細(xì)胞核的形態(tài)變化(×1 000)

圖3 不同濃度Res作用A549細(xì)胞24 h后，P53、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)的Western印跡結(jié)果

3 討 論

早期研究表明，Res能通過降低血液中膽固醇、抑制脂質(zhì)過氧化而減少動脈粥樣硬化、高脂血癥的發(fā)生，抑制血小板聚集從而阻止血栓的形成。之后的研究又發(fā)現(xiàn)，Res具有抗腫瘤特性，可以抑制人乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和急性早幼粒白血病細(xì)胞的增殖〔1～5〕。本實驗研究結(jié)果提示，Res能夠引起A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，明顯抑制細(xì)胞的增殖。不同濃度Res作用后，A549細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞的折光性減弱，且隨著Res濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)變化越明顯，對細(xì)胞的抑制率也明顯增加。

抑癌基因P53作為多種細(xì)胞應(yīng)激與細(xì)胞應(yīng)答的中間環(huán)節(jié)，與其上下游的各種調(diào)控因子及相關(guān)基因共同構(gòu)成了一個錯綜復(fù)雜的信號通路。P53肩負(fù)著介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定、抑制腫瘤血管發(fā)生等多種功能使命，在整個機體組織細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化過程中起著舉足輕重的作用〔6，7〕。P53不僅可以通過下游基因CyclinB1、14-3-3、GADD45、b99等參與細(xì)胞周期阻滯，還可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔8〕。當(dāng)DNA損傷過度無法修復(fù)時，P53則誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡以清除損傷細(xì)胞，其中一種機制為上調(diào)凋亡促進(jìn)因子Bax的表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá)而實現(xiàn)其促進(jìn)凋亡作用〔9〕。本實驗結(jié)果顯示，Res作用A549細(xì)胞后，P53表達(dá)量增加，并下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax的比值降低，增加了線粒體膜的通透性和細(xì)胞色素C的釋放，導(dǎo)致促凋亡基因Caspase3活性增加，啟動細(xì)胞內(nèi)凋亡程序。本實驗中Res作用A549細(xì)胞后，Cleaved-Caspase3激活,Res濃度越高激活越明顯。Caspase3家族屬于天冬氨酸蛋白酶，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起著非常重要的作用，其中Caspase3為關(guān)鍵的效應(yīng)分子，它可催化多種細(xì)胞內(nèi)特異蛋白的激活，在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮著重要功能〔10,11〕。

綜上，本實驗認(rèn)為Res是一個有廣泛應(yīng)用前景的抗癌新藥，其抑制腫瘤細(xì)胞生長是治療肺癌的重要機制。

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