李延玲 張懷宏 翟玉峰

(南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 473000)

肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，腸道菌群失衡產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素具有重要的作用，兩者相輔相成〔1〕。因此，通過調(diào)整腸道菌群以改善肝硬化患者的癥狀、預(yù)防肝硬化并發(fā)癥的發(fā)生等成為研究的熱點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織把益生菌定義為攝取一定數(shù)量后能對機(jī)體產(chǎn)生有益作用的微生物〔2〕。益生菌已被用于治療多種臨床疾病。本實(shí)驗(yàn)探討益生菌對肝硬化大鼠肝細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康SD雄性大鼠50只，180～250 g，由浙江中醫(yī)學(xué)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。益生菌(含雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、腸球菌三聯(lián)活菌)，上海信誼藥業(yè)有限公司,規(guī)格：210 mg/膠囊,含活菌5×107CFU/g(CFU:活菌含量)。四氯化碳(CCl4)，上海申翔化學(xué)試劑有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；TUNEL檢測試劑盒，兔抗鼠Bax抗體、兔抗鼠Bcl-2抗體、磷酸鹽緩沖液均購自武漢博士德生物工程有限公司，PV6003兩步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司。高速低溫離心機(jī)，電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)，電子分析天平，玻璃勻漿器。

1.2肝纖維化動(dòng)物模型的建立 采用橄欖油將CCL4配制成40%油劑，3 ml/kg皮下注射(首次5 ml/kg)，1次/3 d，連續(xù)42 d。并飼以高脂低蛋白食物(玉米面混以0.5%膽固醇)，30%酒精為唯一飲料〔3〕。將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、益生菌低、中、高劑量組，每組10只。正常組皮下注射橄欖油2次/w，同時(shí)每天予等容量蒸餾水灌胃；模型組在造模同時(shí)每天予等容量蒸餾水灌服；益生菌高、中、低劑量組在造模同時(shí)每天予以益生菌高劑量(2.10×107CFU)、中劑量(1.05×107CFU)、低劑量(0.53×107CFU)灌胃，末次給藥后24 h，股動(dòng)脈放血處死大鼠，留取血清和部分肝臟組織，進(jìn)行檢測指標(biāo)測定。

1.3血清肝功能檢測 按試劑盒操作說明，使用日立全自動(dòng)生化分析儀測定大鼠AST、ALT水平變化。

1.4肝組織生化指標(biāo)測定 取少許肝組織，加入預(yù)冷生理鹽水勻漿，4 000 r/min，離心10 min，取上清液，根據(jù)試劑盒操作說明，檢測SOD和MDA活性變化。

1.5肝組織HE染色 取血后處死大鼠，取相同的肝右葉部位，10%甲磷溶醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理學(xué)改變。

1.6TUNEL染色檢測肝細(xì)胞凋亡 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，蛋白酶K修復(fù)，滴加TUNEL混合液，標(biāo)記過氧化酶，DAB顯色、復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察凋亡細(xì)胞，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核呈棕黃色。每片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，以陽性細(xì)胞所占百分比的平均數(shù)為凋亡指數(shù)(AI)〔4〕。

1.7Bax、Bcl-2免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2滅活內(nèi)源性酶10 min,行抗原修復(fù)后，分別滴加一抗 (山羊抗鼠Bax/Bcl-2多克隆抗體 )，陰性對照以PBS代替一抗，4℃過夜，滴加通用型二抗，進(jìn)行DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕黑色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。在光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍不連續(xù)視野，運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)測定平均光密度(OD)值，取平均OD值作為測量值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 正常組大鼠活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤，體重增長可。其余組大鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，體重減輕。

2.2各組血清AST、ALT水平的影響 模型組血清中ALT、AST明顯高于正常組(P<0.05)，說明造模成功。與模型組相比較，益生菌高、中、低劑量組中ALT、AST水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清AST、ALT水平的比較

2.3肝組織中MDA含量、SOD活性的變化 模型組與正常組相比，MDA水平顯著升高，SOD水平明顯下降(P<0.05)，說明建模成功。與模型組相比較，益生菌低、中、高劑量組中MDA含量顯著降低，而SOD含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝組織中MDA、SOD水平的比較

2.4各組肝臟病理組織學(xué)變化 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞無變性壞死，肝竇、匯管區(qū)無擴(kuò)張淤血，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞脂肪樣變，可見點(diǎn)狀、灶狀壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤。匯管區(qū)及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見纖維組織增生，假小葉形成。與模型組相比，益生菌各劑量組肝組織病變有所改善，其中高劑量組改善最為明顯，肝細(xì)胞水腫明顯減輕，肝索結(jié)構(gòu)基本清晰，輕度脂肪樣變，部分匯管區(qū)少量纖維組織增生，炎性細(xì)胞明顯減少。

2.5各組肝組織Bax、Bcl-2表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，正常組可見少量Bax、Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)，與正常組比較，模型組中Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2/Bax明顯降低(P<0.05)；而與模型組比較，益生菌各組肝組織中Bcl-2表達(dá)增高，Bax的表達(dá)較低，Bcl-2/Bax明顯增加(P<0.05)。見表3。

2.6各組肝細(xì)胞凋亡比較 正常組大鼠肝細(xì)胞未見或偶見凋亡細(xì)胞；模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，呈彌漫性分布；益生菌高、中、低劑量組肝細(xì)胞AI(10.19±4.05、15.53±3.16、18.50±4.94)均顯著減輕，以高劑量組最為顯著；明顯高于模型組(28.01±7.42)(P<0.05)，模型組明顯高于對照組(1.28±1.38)(P<0.05)。

表3 各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2光密度分析結(jié)果

3 討 論

在正常生理情況下，肝臟不僅能清除來自腸道的各種毒素，還能清除腸源性細(xì)菌等。但是肝臟功能一旦受損，腸道的微生態(tài)即可發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，從而腸道細(xì)菌及其各種代謝產(chǎn)物將移位進(jìn)入腸外器官，過度激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，引起異常免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、壞死。益生菌具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、抑制腸道致病菌感染以及維持胃腸道菌群平衡的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)益生菌在人的酒精性肝硬化〔5〕，非酒精性脂肪肝類(NASH)〔6〕；鼠的NASH〔7〕模型及半乳糖胺〔8〕或CCl4〔9〕等多種病因所致的肝臟疾病具有一定的治療作用。

ALT、AST在肝細(xì)胞中大量存在，若肝細(xì)胞發(fā)生壞死，其即可被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，其濃度水平在一定程度上可反映肝細(xì)胞受損程度〔10〕。 MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、變性、壞死和凋亡。而SOD是機(jī)體內(nèi)存在的超氧自由基清除因子，可以修復(fù)自由基對肝細(xì)胞造成的損害〔11〕。測定MDA、SOD含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明益生菌對肝損傷有一定的保護(hù)作用。

凋亡是一種主動(dòng)性“細(xì)胞自殺”的過程，對肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)常伴有肝細(xì)胞壞死，引發(fā)肝損傷，導(dǎo)致肝纖維化〔13〕。Bcl-2和Bax為最主要的凋亡蛋白,其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，它可通過抑制氧自由基、與Bax結(jié)合形成雜二聚體、改變胞內(nèi)細(xì)胞器的Ca2+流等而抑制細(xì)胞凋亡〔14〕。而Bax作為Bcl-2的同源體，可抑制Bcl-2的作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔15〕。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2較多時(shí)，Bcl-2和Bax的異源二聚體增多，凋亡趨勢減弱；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax較多時(shí)，則Bax本身形成的同源二聚體占主導(dǎo)，則易于發(fā)生凋亡。Bcl-2/Bax比值對決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有重要意義〔16～19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Bcl-2、Bax參與了肝纖維化的過程。益生菌能抑制或降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制和減輕肝細(xì)胞凋亡。益生菌在降低轉(zhuǎn)氨酶，改善肝功能的同時(shí)，還能減輕對肝細(xì)胞的凋亡，對肝組織起到一定的保護(hù)作用。

益生菌作為一種活菌制劑，在治療肝病的同時(shí)正確使用，可保持患者腸道微生態(tài)平衡，改善肝功能，提高機(jī)體免疫力，保護(hù)肝臟損傷，對病情的恢復(fù)起到積極的作用。益生菌與人體之間的相互關(guān)系和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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