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        復(fù)方地黃方對帕金森病左旋多巴毒副反應(yīng)大鼠淋巴細胞表面多巴胺轉(zhuǎn)運體 mRNA表達的影響

        2014-09-12 02:03:26羅瑞靜何建成
        中國老年學(xué)雜志 2014年3期
        關(guān)鍵詞:帕金森病模型

        羅瑞靜 何建成

        (上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203)

        帕金森病(PD)是一種由內(nèi)、外因素綜合作用導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,迄今其發(fā)病機制尚未完全闡明〔1〕。已有研究認為其發(fā)生與免疫功能失調(diào)有關(guān)〔2〕,并證實PD患者淋巴細胞(PBL)表面多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT) mRNA表達較正常人明顯減少〔3〕,而其經(jīng)典治療藥物左旋多巴長期應(yīng)用亦可使DAT mRNA表達減少〔4〕。中藥復(fù)方地黃方對LD治療PD過程中的毒副反應(yīng)有明顯干預(yù)效果〔5,6〕,且可以通過增加中樞紋狀體內(nèi)DAT的數(shù)量來發(fā)揮干預(yù)作用〔7〕。本實驗研究LD大鼠PBL表面DAT表達的動態(tài)變化情況。

        1 材料與方法

        1.1動物及實驗條件 SD大鼠,雄性,6~8周齡,體重180~200 g,SPF級,110只,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號:SYXK(滬)2004-2005。實驗條件:動物飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,恒溫(23±2)℃,相對濕度60%~65%,自動光-暗控制(LD12:12,即07:00-19:00光照,19:00~07:00暗置),動物攝食飲水及活動自由。

        1.2藥物 戊巴比妥鈉:上海中西藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品(批號:WS20090920);左旋多巴干粉:美國Sigma公司產(chǎn)品(批號:192K1885);芐絲肼:美國Sigma公司產(chǎn)品(批號:BCBB8323);慶大霉素:上海第一制藥廠產(chǎn)品,0.3 g/支(批號:H31021994);復(fù)方地黃方:熟地黃15 g,白芍30 g,珍珠母15 g,丹參20 g,全蝎2 g等(濃度為5.18 g/ml)。由上海雷允上藥材有限公司代加工。

        1.3主要試劑 6-羥基多巴胺(6-OHDA,批號:048K3728),美國Sigma公司,阿撲嗎啡(APO,批號:057K1462),美國Sigma公司,抗壞血酸(批號:063K1082),美國Sigma公司,大鼠淋巴細胞分離液(批號:20100101);上海微科生化試劑有限公司,PCR引物,上海生物工程有限公司,Trizol Reagent,美國Invitrogen公司,Oligo(dT)15,美國Promega公司,M-MuLV Reverse Transcriptase,美國Promega公司,2×Taq PCR Master Mix,上海萊楓生物科技有限公司,dNTPs mix,上海生物工程有限公司,核糖核酸酶抑制劑(RNAsin),美國Promega公司,Spanish Agrose,上海華藍化學(xué)科技有限公司,100 bp DNA ladder,美國Amresco公司,焦碳酸二乙酯(DEPC),美國Amresco公司。

        1.4主要儀器 大鼠腦立體定位儀(TOW-3A型),廣東汕頭市教育醫(yī)學(xué)儀器廠,微量進樣器(5 μl),上海第三分析儀器廠,分析天平(910324),德國Sartorius公司,秒表(926266),上海秒表廠,電動高速勻漿機,美國IKA Works公司,Du7500紫外分光光度計,德國Beckman公司,Heraeus低溫高速離心機,德國Heraeus公司,PCR儀(GeneAmp PCR System 9600),美國Perkinelmer公司,Syngene生物圖像系統(tǒng),美國Bio-Rad公司,核酸電泳槽,美國Bio-Rad公司。

        1.5模型制備方法 在經(jīng)典PD模型基礎(chǔ)上,進一步腹腔注射LD,制備PD左旋多巴毒副反應(yīng)大鼠(LD大鼠)模型〔8~11〕。術(shù)前確認無異常旋轉(zhuǎn)行為后,用3%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上,頭部去毛,苯扎溴銨(商品名:新潔爾滅)常規(guī)消毒。無菌條件下,沿正中線切開大鼠顱頂皮膚,剝離骨膜,暴露前囟。以前囟為準,確定左側(cè)黑質(zhì)二坐標:①前囟后5.2 mm,正中線右側(cè)1.0 mm,硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm,正中線右側(cè)2.5 mm,硬膜下8.5 mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開顱骨,用5 μl微量進樣器將6-OHDA(即將6-OHDA溶于含0.02%抗壞血栓的生理鹽水中,濃度為2 μg/μl)注入右側(cè)黑質(zhì)部(以1.0 mm/min速度緩慢進針),每孔3μL,注射速度為1 μl/min,注射完畢后留針5 min,然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后,用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合切口皮膚,肌肉注射慶大霉素7 d,待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。正常對照組只固定大鼠,不進行任何處理,亦均為10 d。假手術(shù)組開顱后只注射含0.02%抗壞血栓的生理鹽水(濃度為2 μg/μl)。10 d后,以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn),記錄開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均>7次/min者為合格的PD模型。將成功的PD模型大鼠給予腹腔注射左旋多巴/芐絲肼(50 mg/kg LD和12.5 mg/kg芐絲肼即LD和芐絲肼溶于含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸的注射用水中,配成10 mg/ml),2次/d,連續(xù)2 w。正常對照組及假手術(shù)組給予腹腔注射等量的含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸的注射用水,2次/d。2 w后,再次以腹腔注射APO 0.5 mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn),記錄開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較2 w前增加的為合格的LD模型大鼠〔11〕。

        1.6分組及給藥

        1.6.1分組方法 采用區(qū)層隨機法,將成功LD模型大鼠隨機分為兩組:LD模型組(左旋多巴)、復(fù)方地黃湯組(復(fù)方地黃湯+左旋多巴),每組12只。另取正常對照組和假手術(shù)組,每組12只。然后再將各組分為4、6 w兩組,每組6只。

        1.6.2給藥 LD模型組大鼠在腹腔注射左旋多巴/芐絲肼(50 mg/kg左旋多巴和12.5 mg/ml芐絲肼)的基礎(chǔ)上給予生理鹽水灌胃;復(fù)方地黃湯組大鼠在腹腔注射左旋多巴/芐絲肼的基礎(chǔ)上給予中藥灌胃;正常對照組及假手術(shù)組給予腹腔注射等量的含0.05%的乙醇和0.1%的抗壞血酸的注射用水的基礎(chǔ)上給予生理鹽水灌胃。每次灌胃量為2 ml,1次/d。

        1.7大鼠血PBL分離 所有動物在處死前均從腹腔注射麻醉劑(水合氯醛10%,0.4 ml/100 g),待動物麻醉后,腹主動脈取血5 ml,置于肝素抗凝管中,用密度梯度離心法分離淋巴細胞。取新鮮抗凝血5 ml,與生理鹽水1∶1 混勻后,將其小心加于5 ml淋巴細胞分離液的液面上,以5 000 r/min離心(半徑15 cm水平轉(zhuǎn)子)15 min,此時離心管中由上至下細胞分四層:第一層為血漿或組織勻漿液層;第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞或單核細胞層;第三層為透明分離液層;第四層為紅細胞層。用吸管收集第二層于另一試管中,加入0.01 mol/L PBS10 ml(pH7.4),3 000 r/min離心洗滌5 min×3次,棄去上清液,隨后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.8RNA的抽提及RT-PCR

        1.8.1RNA的提取 實驗所需物品的處理:所用玻璃器皿均經(jīng)160~180℃高溫干燥6 h以上,非耐高溫器皿經(jīng)0.1%DEPC浸泡后,經(jīng)高壓(20磅,15 min)處理滅活RNA,所用試劑均用DEPC水配制后高壓處理。①細胞解凍后,加入PBS 5 ml離心,3 000 r/min,5 min,棄上清,②加Trizol 1 ml,上下顛倒數(shù)次,室溫5 min,③加氯仿250 μl,用力振蕩約30 s,室溫靜置10 min,④2 000 r/min×15 min,4℃,上清液移入新管(含RNA),⑤加500 μl異丙醇,上下顛倒數(shù)次,室溫靜置10 min,⑥12 000 r/min×10 min,4℃,棄上清,⑦加75%乙醇1 ml,振搖后離心,7 500 r/min×5 min,4℃,⑧加30 L DEPC水溶解,然后紫外分光光度計測定OD值,-70℃保存。

        1.8.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) DAT引物序列為:基因庫查找號:S76145,上游: 5′- GCT CTA CTT CAG CCT ATG GA-3′,下游: 5′- GTG GTG ATG ATT GCG TCT-3′,產(chǎn)物為: 300 bp;β-actin引物序列為:上游:5′- AAG CAG GAG TAT GAC GAG TCC G -3′,下游:5′- GCC TTC ATA CAT CTC AAG TTG G -3′ 產(chǎn)物為:550 bp,在0.2 ml無RNA的PCR管中依次加入以下試劑:Total RNA(1 g/μl) 3 μl;Oligo dT(15) (0.5 g/μl) 1 μl;DEPC (RNase-free)調(diào)體積至12.5 μl;70℃變性5 min,冰浴5 min;5×RT buffer 4 μl;10 mmol/L 4dNTP mix 2 μl;RNA sin(40 U/μl)0.5 μl;M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl)1 μl;42℃,60 min;72℃,10 min;之后迅速在冰上冷卻5 min。

        1.8.3PCR擴增反應(yīng) 在0.2 ml PCR管中依次加入以下試劑:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl;2×Taq PCR Master Mix 25 μl;Sense/antisense primer 1 μl(each);DEPC 21 μl;94℃ 1 min;30個循環(huán),58℃ 1 min;72℃ 1 min;72℃ 10 min。

        1.8.4DNA電泳鑒定及圖像分析 PCR產(chǎn)物5 μl上樣于2%瓊脂糖凝膠,電壓為100 V,進行電泳。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Image Master Software)進行條帶光密度分析,經(jīng)β-actin校正得到相對光密度值。

        2 結(jié) 果

        LD模型組、復(fù)方地黃方組在4、6 w時均明顯低于正常對照組及假手術(shù)組(P<0.001);復(fù)方地黃方組分別在4、6 w時明顯高于LD模型組(P<0.001)。復(fù)方地黃方組DAT mRNA表達較LD模型組明顯增強,伴隨給藥時間延長,LD模型組表達有減少趨勢,而復(fù)方地黃方組有增加趨勢。正常對照組、假手術(shù)組及復(fù)方地黃方組不同時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);LD模型組在6 w時明顯低于4 w時(P<0.01)。見表1,圖1。

        表1 各組大鼠PBL中 DAT mRNA表達的比較

        1.Marker;2.正常對照組;3.假手術(shù)組;4.LD模型組(4 w);5.復(fù)方地黃方組(4 w);6.LD模型組(6 w);7.復(fù)方地黃方組(6 w)

        3 討 論

        已有研究表明,PD的發(fā)生是多因素綜合作用結(jié)果〔1〕,其中與機體免疫功能異常有密切關(guān)系〔2〕。PD患者PBL表面DAT表達異常已為大量實驗證實〔3,4,12,13〕,但其具體機制尚未闡明。而LD對PD外周血淋巴細胞膜表面DAT表達的影響尚無統(tǒng)一認識,基于復(fù)方地黃方良好的干預(yù)效果,本次實驗以PBL表面DAT為觀察對象來探討其干預(yù)機制。

        有研究表明〔3〕,PD患者外周血淋巴細胞DAT數(shù)量明顯低于正常人,但LD對其影響情況,已有研究結(jié)果并不一致,張璟等〔12〕研究顯示,LD治療對PD患者外周血淋巴細胞DAT數(shù)量沒有影響,而陳嬿等〔4〕研究顯示LD治療組較非LD治療組低。本次實驗研究結(jié)果與課題組前期對中樞紋狀體內(nèi)DAT研究結(jié)果基本一致〔7〕,提示DAT基因表達及數(shù)量異常與LD治療PD時毒副反應(yīng)發(fā)生存在一定關(guān)系,而復(fù)方地黃方則可以通過提高DAT表達增加其數(shù)量來發(fā)揮“減毒增效”作用。

        復(fù)方地黃方中熟地黃補腎益精、固本培元,為君藥;珍珠母平肝潛陽,白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止顫,共為臣藥;丹參養(yǎng)血活血化瘀,全蝎祛風(fēng)通絡(luò)、活血化痰,共為佐藥。諸藥合用,共奏滋腎補肝、平肝熄風(fēng)、化痰祛瘀之功。前期研究〔7〕證實該方可以增加DA含量,DAT表達及數(shù)量上調(diào)是否與DA含量增加有關(guān),還是復(fù)方地黃方直接促進了DAT表達及數(shù)量上調(diào)等具體作用機制尚需進一步研究。

        4 參考文獻

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