孫東業(yè) 張 濤 朱貴明 田黎明 張英海 杜靜平

(佳木斯大學醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

溶菌酶可水解細菌胞壁的肽聚糖，從而使細菌溶解，并有激活補體和促吞噬、抗感染、抗腫瘤和免疫調節(jié)等作用，具有潛在的臨床價值〔1,2〕。溶菌酶廣泛存在于各種體液、外分泌液和吞噬細胞溶酶體中，而要大量獲得，基因工程是首選。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有表達水平高、操作簡單、周期短、成本低等優(yōu)點。但人溶菌酶(hLYZ)在原核中表達會引起宿主菌“自殺”性死亡，且翻譯后缺乏修飾，包涵體的復性操作復雜，獲得足量天然蛋白較困難〔3,4〕；而在酵母和霉菌中表達存在與大腸桿菌類似的問題〔5〕。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)盡管表達量可能欠缺，但可以實現真正的分泌表達，使產物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質更接近，藥用更可靠〔6〕。本研究構建真核可溶性表達載體pSecTag2/Hygro-hLYZ，利用脂質體共轉染技術在CHO/dhfr-細胞中表達，為工程化、規(guī)模化生產hLYZ奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 人胎盤組織由北京大學婦產兒童醫(yī)院手術室提供。CHO-K1/ dhfr-細胞系株及帶有 pSV2-DHFR質粒的DH5α菌株：由中國科學院遺傳所徐玖瑾教授提供；分泌型真核表達載體pSecTag2/HygroB及陽性對照質粒PSA/Hygro購于invitrogen公司；pMD18-T vector載體、dNTP混合液、限制性內切酶Xho I、EcoR V，T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司； DNA快速提取試劑盒、DNA片段膠回收試劑盒購自博大泰克； IPTG、X-Gal、核酸染料購自北京江晨生物技術公司；總RNA快速抽提純化試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.2方法 從新鮮的人胎盤組織中分離提純總RNA，經RT-PCR，用合成的特異引物進行PCR擴增，膠回收產物用T4連接酶將其連接到pMD18-T載體上，轉化入DH5α感受態(tài)細胞，獲得陽性克隆。把連接在pMD18-T載體上的hLYZ cDNA片段用限制性內切酶EcoR V和Xho Ⅰ雙酶切，再將回收的目的條帶連接到真核分泌性表達質粒pSecTag2/HygroB上。經菌液PCR和雙酶切鑒定，hLYZ因成功連接到表達載體上。利用脂質體技術,將含hLYZ基因的pSecTag2/HygroB-hLYZ 載體和pSV2/dhfr-2DNA 質粒(3∶1)與脂質體按4∶6比例轉染CHO/dhfr-中。經添加潮霉素B抗生素和氨甲蝶呤(MTX)并撤除H、T(次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷) 雙篩選下,獲得了24株陽性細胞克隆體。RT-PCR驗證hLYZ基因已整合入基因組中，并有其mRNA的轉錄。隨機挑選一株擴大培養(yǎng)并換用無血清培養(yǎng)基,在MTX加壓下擴增DHFR 基因；隨DHFR共轉染的編碼hLYZ的基因序列也得到擴增，進而使目的蛋白表達量得到提高，收集細胞上清培養(yǎng)液經Ni+-Resin過柱純化。純化后的蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚酰胺基凝膠(SDS-PAGE)和Western印跡鑒定。

2 結 果

2.1hLYZ cDNA的克隆

2.1.1hLYZ基因的克隆與鑒定 電泳顯示PCR擴增獲得了特異性目的產物。 將電泳回收到的RT-PCR產物與pMD18-T 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選，白色菌落為重組轉化體。菌落PCR初步篩選鑒定后，再進行酶切鑒定。用限制性內切酶EcoR V和Xho I對重組轉化體進行雙酶切鑒定與菌液PCR檢測結果一致，都產生同樣大小(434 bp)預期片段。初步篩選得到陽性克隆。見圖1A。將獲取的陽性重組質粒pMD18-T-hLYZ進行測序，進一步證實PCR結果。

2.1.2人溶菌酶真核表達載體的構建 pMD 18-T-HLYZ克隆質粒與pSecTag2/Hygro真核表達載體分別用EcoR V和Xho I進行雙酶切、連接、轉化大腸桿菌DH5α細胞。接種于Amp/LB平板培養(yǎng)基，經抗生素篩選挑取單個菌落于Amp/LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液PCR檢測為陽性后用博大泰克質粒小量提取試劑盒提質粒。質粒用EcoR V、Xho I進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳R約430 bp的清晰單一條帶，初步判定重組質粒構建成功。見圖1B。

2.2人溶菌酶基因在CHO/dhfr-細胞中的分泌性表達 將構建的人溶菌酶基因重組真核分泌性表達質粒pSecTag2/HygroB-hLYZ與pSV2-DHFR質粒利用脂質體共轉染技術導入CHO/dhfr中，潮霉素B篩選得到的陽性克隆經MTX加壓擴增，收集細胞上清培養(yǎng)液經Ni+-Resin過柱純化，純化蛋白液經SDS-PAGE 和Western印跡鑒定結果，見圖1C、圖1D。

A：pMD18-T-hLYZ載體的菌落PCR及酶切鑒定分析，M：MakerⅢ 由上到下為4 500、3 000、2 000、1 200、800、500、200 bp，1: pMD18-T-hLYZ重組質粒經EcoR V和Xho Ⅰ雙酶切，2： pMD18-T-hLYZ重組質粒菌落PCR產物；B：pSecTag2/Hygro-hLYZ重組質粒菌液PCR及酶切鑒定分析，M1: 1 kb DNA Ladder，由上到下依次為10、8、6、3.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、750、500、250 bp，M2: MakerⅢ，1：pSecTag2/HygroB質粒EcoR V酶切，2: pSecTag2/Hygro-Hlyz(6F)重組質粒EcoRV和Xho1雙酶切，3:菌液PCR產物hLYZ片段，4:菌液PCR空白對照(未加引物)；C：融合蛋白hLYZ-6×His在CHO/dhfr-細胞中的表達、純化后結果，M: SDS-PAGE低分子量標準蛋白Maker,由上到下依次為97、66.2、43、31、20.1、14.4 kD，1：Hygro-DHFR/CHO純化上清，2：LYZ-DHFR/CHO純化上清；D：Western印跡鑒定結果，M: SDS-PAGE低分子量標準蛋白Maker，1、2: LYZ-DHFR/CHO培養(yǎng)上清，3、4:Hygro-DHFR/CHO培養(yǎng)上清

圖1各實驗電泳結果

3 討 論

本實驗設計了人溶菌酶成熟蛋白130個氨基酸cDNA的特異引物及基因兩端與表達載體相對應的酶切位點,考慮到融合表達蛋白融合片段對目的蛋白活性的影響，又在引物5'端加上腸激酶酶切位點序列，表達的融合蛋白純化后經腸激酶作用，把N-和C-端多余序列切除，可使殘留氨基酸不影響HLYZ的空間結構。另外在下游引物靠近酶切位點處增加了一個堿基，以保證插入片段下游氨基酸翻譯的讀碼正確。最終成功獲得了長度為390 bp目的片段，雖在105位置有變異(C→U)，但由于是密碼子的第三位堿基，GGU并不影響甘氨酸的翻譯，所得hLYZ一級結構沒有變化，說明載體克隆成功。本實驗利用脂質體共轉染劑技術，在潮霉素最佳篩選濃度的作用下，獲得了24株抗性單克隆。為進一步獲得高表達蛋白細胞株生產制備人用溶菌酶藥物做了上游技術水平的開發(fā)研究。

根據實驗結果，還將進一步做些工作：①對篩選得到的陽性單細胞克隆要進一步做蛋白的表達定量測定，篩選高表達蛋白細胞株；②對所得到的人溶菌酶融合蛋白進行腸激酶酶切及生物活性的鑒定。

4 參考文獻

1劉淑鑫，李萇清，袁新華，等. 溶菌酶醫(yī)學應用研究概況〔J〕. 中國醫(yī)藥指南,2011；9(21)：226-8.

2Lenander-Lumikari M,Mansson-Rahemtulla B,Rahemtulla F. Lysozyme enhances the inhibitory effects of the peroxidase system on glucose metabolism of Streptococcus mutans〔J〕. J dent Res，1992；71 (3)：484-90.

3謝 磊，孫建波，張世清，等. 大腸桿菌表達系統(tǒng)及其研究進展〔J〕. 華南熱帶農業(yè)大學學報， 2004；10 (2)：16-20.

4歐陽萍，雷連成;，呂 爽，等. 人溶菌酶基因的原核表達及其生物學活性〔J〕. 中國生物制品學雜志，2009；22 (6)：544-7.

5胡 喬，趙凌俠，唐克軒. 在畢赤酵母中表達人溶菌酶蛋白的研究〔J〕. 上海交通大學學報(農業(yè)科學版)， 2008；26(3)：233-6.

6陳 茜. 新型牛溶菌酶基因的重組真核質粒構建及活性研究〔D〕. 四川大學碩士論文，2007.