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        siRNA干擾GADD45聯(lián)合順鉑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

        2014-09-12 06:10:30
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2014年6期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期孵育空白對(duì)照

        章 俊

        (貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科,貴州 貴陽(yáng) 550004)

        GADD45是細(xì)胞和DNA損傷的應(yīng)激基因,在電離輻射、紫外線、和化療藥物等的刺激下由抑癌基因p53誘導(dǎo)表達(dá),調(diào)控細(xì)胞周期G2期檢驗(yàn)點(diǎn)〔1,2〕。GADD45基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸存在密切關(guān)系,并且在腫瘤細(xì)胞凋亡中起級(jí)聯(lián)橋梁作用,有研究用cDNA微陣列方法對(duì)惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)行分析,并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)GADD45在其中表達(dá)上調(diào),且與患者的預(yù)后相關(guān),其中過(guò)表達(dá)GADD45的患者預(yù)后明顯較好〔3~6〕。因此,GADD45作為一種獨(dú)立的腫瘤預(yù)后標(biāo)志因子, 在某種程度上可反映腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。 由于老年人的一些重要器官肝臟、腎臟、骨髓生理功能減弱,進(jìn)而耐受腫瘤化療的能力也隨之減弱,因此,開辟新的治療途徑迫在眉睫。本研究通過(guò)siRNA干擾方法抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中GADD45基因的表達(dá),同時(shí)聯(lián)合化療藥物順鉑觀察其聯(lián)合作用對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

        1 材料與方法

        1.1細(xì)胞株和試劑 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基由美國(guó)Gibco公司提供。順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥廠。GADD45基因siRNA干擾序列及轉(zhuǎn)染試劑由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。RIPA蛋白裂解液和線粒體/胞漿蛋白提取試劑盒、Caspase-3、Caspase-9和Cytochrome C活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司提供。四甲基氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人GADD45一抗和羊抗鼠二抗均購(gòu)于南京巴傲德生物科技有限公司。

        1.2方法

        1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代后置含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),隔2~3 d傳代1次。

        1.2.2siRNA沉默GADD45 選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液(3.0×105/ml)接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔1.0 ml細(xì)胞懸液,12 h細(xì)胞貼壁后,參照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)操作,設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:空白對(duì)照組(未經(jīng)RNA干擾處理的SKOV-3細(xì)胞);GADD45 siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染GADD45 siRNA的SKOV-3細(xì)胞);陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的SKOV-3細(xì)胞)。孵育24 h后收集細(xì)胞。

        1.2.3Western 印跡法檢測(cè)GADD45蛋白抑制效果 在上述3組細(xì)胞中加入200 μl RIPA蛋白裂解液裂解SKOV-3細(xì)胞后,按照說(shuō)明書步驟提取蛋白,制作聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠,取不同組別的等量蛋白樣品進(jìn)行電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育和洗滌(一抗稀釋比為:1∶1 000;二抗稀釋比為:1∶5 000)。ECL顯色后, 經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描曝光并通過(guò)機(jī)器自帶軟件分析比較各組蛋白條帶的灰度值。

        1.2.4細(xì)胞增殖率試驗(yàn) 選處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,以每孔6.0×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。順鉑濃度參考本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及國(guó)內(nèi)外其他文獻(xiàn)報(bào)道,選用臨床血藥濃度的一半劑量2 mg/L。細(xì)胞隨機(jī)分成5組:①空白對(duì)照組(不加任何處理);②陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA序列);③干擾組(轉(zhuǎn)染GADD45 siRNA序列);④順鉑組(2 mg/L順鉑處理);⑤聯(lián)合組(轉(zhuǎn)染GADD45 siRNA序列+2 mg/L順鉑處理),每孔細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔。孵育24 h候后,移去含有順鉑的細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入100 μl MTT 溶液(終濃度為0.05 mg/ml),37℃孵育4 h,棄上清,每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解結(jié)晶,采用Synergy 2型多功能酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定光密度(OD)值。

        1.2.5流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 SKOV-3細(xì)胞按1.2.4方法處理24 h后,洗滌并消化,用250 μl PBS重懸細(xì)胞,加入0.75 ml無(wú)水乙醇混勻,4℃固定6 h以上,收集細(xì)胞,用900 μl PBS重選細(xì)胞,加入RNaseA (終濃度為1 μg/ml) 37℃孵育30 min,在以上實(shí)驗(yàn)體系中加入100 μl PI (終濃度為10 μg/ml)染液,室溫避光孵育20 min,于流式細(xì)胞儀上由專業(yè)技術(shù)人員檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

        1.2.6流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 SKOV-3細(xì)胞按1.2.4方法處理24 h后,洗滌并消化,離心收集細(xì)胞制備成濃度為3.0×106/ml單細(xì)胞懸液,取100 μl細(xì)胞懸液,加入400 μl 1×上樣緩沖液重懸細(xì)胞,分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI混勻,室溫避光孵育30 min,于流式細(xì)胞儀上由專業(yè)技術(shù)人員檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

        1.2.7Caspase-3和Caspase-9活性及胞質(zhì)Cytochrome C水平 SKOV-3細(xì)胞按1.2.4方法處理24 h后,制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×106/ml,每106個(gè)細(xì)胞加入1 ml細(xì)胞裂解液,參照試劑盒方法分別提取總蛋白和胞漿蛋白,其中,總蛋白用于檢測(cè)Caspase 3和Caspase 9活性,胞質(zhì)蛋白用于檢測(cè)胞質(zhì)Cytochrome C水平,檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

        2 結(jié) 果

        2.1GADD45 siRNA對(duì)SKOV-3細(xì)胞中Gadd蛋白表達(dá)的抑制情況 Western 印跡法結(jié)果表明GADD45 siRNA干擾組GADD45蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01);而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組QADD45蛋白表達(dá)水平比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

        2.2細(xì)胞增殖率檢測(cè)結(jié)果 相對(duì)于空白對(duì)照組(100±3.2)和陰性對(duì)照組(97±4.4),干擾組(87±6.9)、順鉑組(82±3.3)及聯(lián)合組(71±8.2)細(xì)胞增殖均顯著降低(P<0.01);另外,相比于順鉑組,聯(lián)合組細(xì)胞增殖率亦顯著降低(P<0.01)。

        2.3細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,干擾組、順鉑組和聯(lián)合組細(xì)胞周期各時(shí)相均有顯著變化。其中,干擾組相比于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,G0/G1和S期細(xì)胞分布百分比顯著升高(P<0.01),G2/M期細(xì)胞百分比則顯著降低(P<0.01);順鉑組相比于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,G0/G1和G2/M期細(xì)胞分布百分比顯著增多(P<0.01),而S期期細(xì)胞分布百分比則顯著減少(P<0.01);聯(lián)合組中G0/G1期細(xì)胞分布百分比多于干擾組而少于順鉑組(P<0.01),S期細(xì)胞分布百分比少于干擾組而多于順鉑組(P<0.01),G2/M期細(xì)胞分布百分比則同時(shí)顯著多于干擾組和順鉑組(P<0.01)。見表1。

        圖1 Western印跡檢測(cè)三組SKOV-3細(xì)胞中Gadd45蛋白表達(dá)

        表1 不同處理方式對(duì)SKOV-3細(xì)胞周期分布的影響

        2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 相對(duì)于空白對(duì)照組(3.3±0.14)和陰性對(duì)照組(4.3±0.16),干擾組(15.4±0.21)、順鉑組(25.3±0.24)和聯(lián)合組(37.7±0.44)細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.01);另外,聯(lián)合組凋亡細(xì)胞率相對(duì)于順鉑組亦明顯升高(P<0.01)。

        2.5Caspase 3和Caspase 9活性及胞質(zhì)中Cytochrome C水平變化 相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,干擾組、順鉑組和聯(lián)合組細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9活化程度及胞質(zhì)中Cytochrome C水平均顯著升高(P<0.01);另外,聯(lián)合組細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9活化程度及Cytochrome C水平明顯高于順鉑組(P<0.01)。見表2。

        表2 各組細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9和Cytochrome C活性的影響

        3 討 論

        絕大部分化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡均是通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)DNA損傷發(fā)生時(shí),抑癌基因p53被激活,活化的p53可以在轉(zhuǎn)錄水平激活GADD45的表達(dá),以p53依賴性方式誘導(dǎo)表達(dá)增加的GADD45蛋白可以在B23蛋白的協(xié)助下進(jìn)人細(xì)胞核,在細(xì)胞核內(nèi),GADD45蛋白的中心結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CDC-2相互作用,使具有細(xì)胞周期依賴性激酶作用的CDC-2/CYCLIN-B1蛋白復(fù)合體解離,繼而形成GADD45/CDC-2復(fù)合體,而新形成的GADD45/CDC-2復(fù)合體則不具備細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)作用,無(wú)法使細(xì)胞完成由G2期向M期的過(guò)渡,從而誘發(fā)細(xì)胞周期G2/M阻滯〔7〕。通過(guò)以上過(guò)程使DNA損傷的細(xì)胞有足夠的時(shí)間完成DNA修復(fù),如修復(fù)不完全細(xì)胞則通過(guò)啟動(dòng)程序性凋亡來(lái)阻止受損DNA傳遞到下一代,而DNA損傷修復(fù)則是腫瘤細(xì)胞耐受化療藥物造成的DNA損傷而繼續(xù)存活的關(guān)鍵事件。因此,我們?cè)O(shè)想通過(guò)siRNA干擾技術(shù)抑制GADD45基因表達(dá),使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路p53-GADD45受阻,導(dǎo)致受損腫瘤細(xì)胞無(wú)法及時(shí)完成DNA損傷修復(fù)過(guò)程進(jìn)而增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性(啟動(dòng)細(xì)胞凋亡)。

        MTT和細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,相對(duì)于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,干擾組、順鉑組和聯(lián)合組細(xì)胞死亡率明顯增加;同時(shí),聯(lián)合組細(xì)胞死亡率亦顯著高于順鉑組,這說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)體系中,GADD45沉默和順鉑處理兩者聯(lián)合作用有明顯的協(xié)同作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在本實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭校珿ADD45基因被沉默后,順鉑處理的SKOV-3細(xì)胞由G0/G1期向S期,以及S期向G2/M期轉(zhuǎn)換率明顯增加,由于G2/M期細(xì)胞增多又是細(xì)胞DNA損傷的普遍反應(yīng)〔8〕,因此,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。

        Caspase家族成員是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡執(zhí)行過(guò)程中的主要成員,在細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后,Caspases家族會(huì)被級(jí)聯(lián)激活,其中Caspase-9為凋亡始動(dòng)因子,位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游,它可以在其他蛋白參與下發(fā)生自我活化并激活下游凋亡執(zhí)行因子Caspase-3,后者則作用于特異性底物使細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔9〕。又由于Cytochrome C從線粒體釋放至細(xì)胞漿中是線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的標(biāo)志事件,這說(shuō)明線粒體在GADD45沉默對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

        綜上所述,本研究采用的靶向GADD45的siRNA可以有效地抑制SKOV-3細(xì)胞中GADD45基因的表達(dá),并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期時(shí)相分布,阻礙DNA受損細(xì)胞及時(shí)修復(fù)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。因此,GADD45基因沉默結(jié)合傳統(tǒng)順鉑化療可能在人卵巢癌的治療中具有廣泛的應(yīng)用前景,在以后的研究中,還需要用更多種類的化療藥物和卵巢癌細(xì)胞,以進(jìn)一步分析GADD45基因靶向siRNA干擾與化療敏感性之間的關(guān)系。

        4 參考文獻(xiàn)

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