李吉河 杜 娟 崔 巖 董文鵬 劉 楓

(大慶油田總醫(yī)院腎內(nèi)科透析室，黑龍江 大慶 163319)

持續(xù)的系膜增殖和系膜基質(zhì)增多可導致不可逆性腎小球硬化〔1〕，抑制系膜細胞增殖是增殖性腎小球疾病重要的治療策略。S100A4是S100基因家族成員，是一種鈣結(jié)合蛋白〔2〕，參與腎組織內(nèi)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程〔3〕，其對腎小球系膜細胞增殖是否有影響尚未見報告。本研究通過體外培養(yǎng)大鼠系膜細胞，探討降低S100A4表達對系膜細胞增殖的調(diào)控作用。

1 材料方法

1.1實驗材料 1640細胞培養(yǎng)粉劑及Tri201試劑(GIBCO公司)；MicroBCA蛋白濃度檢測試劑盒、MTT(Sigma公司)；小牛血清(Fetal bovine serum,FCS，Hycolon公司)；羊S100A4抗體、小鼠p21抗體、小鼠cyclinD1抗體、小鼠CDK2抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG、脂質(zhì)體TransPass R2 Transfection Reagent(Biolab公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen life technologies公司)；PCR試劑 (TaKaRa Biotechnology公司)；ECL顯色試劑盒(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2大鼠腎小球系膜細胞系RMC的培養(yǎng) 雄性Wistar大鼠160～200 g由吉林大學動物中心提供。無菌條件下取雙側(cè)腎臟，剝離腎包膜，腎皮質(zhì)剪成碎塊，放于重疊的三層不銹鋼篩網(wǎng)上。收集第二層篩網(wǎng)上的組織移入離心管，V型膠原酶(0.5 mg/ml)消化，15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)原代的系膜細胞，7 d傳代，經(jīng)Desmin(+)、Ⅷ(-)鑒定后，用于以下實驗。

1.3S100A4-15siRNA的設計與合成 根據(jù)Genbank中大鼠S100A4-15 mRNA全長序列(AB020759.1)設計抑制siRNA的靶序列：5'-AAGCCTTCTGTTCCTGCTACA-3'，經(jīng)上海吉瑪公司合成雙鏈siRNA(siS100A4)，正義鏈:5'-GCCUUCUGUUCCUGC UACAtt-3'，反義鏈:3'-ttCGGAAGACAAGGACGAUGU-5'。同時合成無關(guān)siRNA序列作為對照(siCon)：正義鏈:5'-UUCUCC GAACGUGUCACGUtt-3'，反義鏈:3'-ttTTAAGAGGCUUGCACA GUGCA-5'。合成的雙鏈siRNA用DEPC處理的水溶解至100 μmol/L，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4siRNA轉(zhuǎn)染 細胞長至50%～60%左右(以12孔板為例)，進行如下轉(zhuǎn)染步驟(NEB TransPass R2試劑盒)： ①25 μl A液加入0.6 ml無血清1640培養(yǎng)液中，混勻。②再加入2.5 μl B液體，混勻。③加入終濃度為100 nmol/L的siRNA(siCon或siS100A4)。④室溫靜置孵育20 min。⑤期間待轉(zhuǎn)染細胞用無血清1640清洗1遍。⑥孵育液加到細胞培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)4 h。⑦細胞中加1 ml正常RPMI 1640培養(yǎng)液(含血清)。⑧過夜培養(yǎng)。⑨更換新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h備用。

1.5細胞增殖的檢測

1.5.1MTT法檢測細胞增殖能力 大鼠系膜細胞10 000個/孔接種于96孔板，無血清同步16 h后分為以下4組：①無血清組；②10%FCS正常培養(yǎng)組；③10%FCS+siCon組；④10%FCS+siS100A4組，37℃孵育24～48 h。在到達各時間點時棄去培養(yǎng)液，加入MTT(終濃度5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，吸去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 200 μl，室溫溶解15 min，分光光度計490 nm讀取OD值。每組設6個復孔，共重復3次。

1.5.2流式細胞儀檢測細胞周期 系膜細胞傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中，無血清同步16 h后分組同上。培養(yǎng)24 h后收集細胞，PBS液洗2次，加入75%乙醇固定，4℃過夜，次日離心后PBS液洗2次，重懸于0.5 ml PBS中。樣品經(jīng)RNA酶(50 μg/ml)處理后，碘化丙啶(PI，50 μg/ml)室溫避光染色30 min后上機。應用BD流式細胞分析儀的FACScan測量DNA含量，細胞周期變化數(shù)據(jù)用 CellFIT Cell Cycle Analysis Version 2.0 1.2軟件分析(BD公司)，以細胞周期各時相細胞百分率記錄數(shù)據(jù)并分析。每組3瓶，重復3次。

1.6Western印跡法檢測S100A4對細胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21、cyclin D1、CDK2表達 系膜細胞傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)染、無血清同步16 h后分組同上；培養(yǎng)48 h后0.25%胰酶消化收集細胞。Western印跡法步驟同上：最后分別加入小鼠cyclinD1抗體(1∶100稀釋)、小鼠p21抗體(1∶100稀釋)、小鼠CDK2抗體(1∶100稀釋)、兔β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，室溫孵育4 h；TBST洗膜3次，分別加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀釋)、羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育45 min；TBST洗膜3次；ECL顯影。ALPHAIMAGER 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測S100A4對系膜細胞增殖速率的影響 轉(zhuǎn)染抑制S100A4的siS100A4后48 h細胞數(shù)明顯低于正常對照組和無關(guān)siRNA(SiCon)組(P<0.05)，見表1。

2.2S100A4對系膜細胞周期的影響 siRNA抑制S100A4組S期細胞以及S+G2/M期細胞數(shù)(增殖指數(shù))明顯低于正常對照組及無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，見表2。

表1 MTT檢測S100A4對系膜細胞增殖速率的影響

表2 流式細胞儀檢測細胞周期

2.3Western印跡法檢測周期蛋白CDK2、cyclinD1 和p21的表達變化 siRNA抑制S100A4 48 h后，細胞周期蛋白CDK2和CyclinD1均明顯低于正常對照組及無關(guān)siRNA轉(zhuǎn)染組(CDK2 10%FCS+siS100A4組:0.61±0.02 vs.10%FCS正常培養(yǎng)組:0.33±0.01；10%FCS+siCon組0.35±0.01P<0.05，n=3，CyclinD1 10%FCS+siS100A4組:0.61±0.02 vs.10%FCS正常培養(yǎng)組:0.51±0.01；10%FCS+siCon組0.46±0.01P<0.05，n=3)；同樣p21(10.45±0.01，P<0.05)也出現(xiàn)類似的變化趨勢。見圖1。

圖1 Western印跡法檢測細胞周期蛋白的表達

3 討 論

本結(jié)果提示S100A4可能是細胞增殖的正調(diào)控因子，與其在心肌和平滑肌細胞的作用研究結(jié)果類似〔3～5〕。細胞周期的改變必然伴隨著細胞周期蛋白的變化。在人類增殖性腎炎組織中腎小球內(nèi)E2F1、cyclinD1、CDK2等細胞周期相關(guān)調(diào)控因子的表達顯著上調(diào)〔6〕。本研究結(jié)果證實抑制S100A4可引起促進細胞進程的相關(guān)蛋白CyclinD1和CDK2的表達水平降低。但抑制細胞周期進程的基因p21卻同樣出現(xiàn)了下調(diào)，該基因的表達下調(diào)，可能是細胞周期負反饋調(diào)節(jié)的代償現(xiàn)象，雖然表達下調(diào)，但可能不足以抑制促進細胞周期進程的相關(guān)蛋白的作用。

4 參考文獻

1Mima A,Abe H,Nagai K,etal.Activation of Src mediates PDGF-induced Smad1 phosphorylation and contributes to the progression of glomerulosclerosis in glomerulonephritis〔J〕.PLoS One,2011;22;6(3):e17929.

2Garrett SC，Varney KM，Weber DJ，etal.S100A4，a mediator of metastasis〔J〕.J Biol Chem，2006;281(2)：677-80.

3Fernandez-Fernandez MR，Veprlntsev DB，F(xiàn)ersht AR.Proteins of the S100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2005;102(3)：4735-40.

4Liu T,Li Y,Lin K,etal.Regulation of S100A4 expression via the JAK2-STAT3 pathway in rhomboid-phenotype pulmonary arterial smooth muscle cells exposure to hypoxia〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2012;44(8):1337-45.

5Sack U,Walther W,Scudiero D,etal.Novel effect of antihelminthic Niclosamide on S100A4-mediated metastatic progression in colon cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst,2011;103(13):1018-36.

6Xie Y，Chen X.Epidemiology，major outcomes，risk factors，prevention and management of chronic kidney disease in China〔J〕.Am J Nephrol，2008；28：1-7.