于 洋 趙丹玉 王艷杰 馮曉帆 高海寧 楊小靜 柳 春

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

胰島素抵抗(IR)是多種代謝相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)〔1〕。血管內(nèi)皮表面積減少和內(nèi)皮功能紊亂(ECD)是促進(jìn)IR的重要原因。同時(shí)ECD已經(jīng)成為2型糖尿病(T2DM)及其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)關(guān)鍵因素及病理基礎(chǔ)，并貫穿于病程的始終〔2〕。研究〔3〕證實(shí)糖尿病(DM)患者及DM動(dòng)物模型中存在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性降低及一氧化氮(NO)合成減少。NO是最主要的血管舒張因子，使血管舒張，血流增加，促進(jìn)胰島素向組織正常轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)行糖的正常代謝，穩(wěn)定血糖的濃度〔4〕。滋陰補(bǔ)腎傳統(tǒng)經(jīng)方六味地黃丸(LWDHP)具有改善IR、降糖降脂之功效，臨床應(yīng)用其治療DM具有很大的優(yōu)勢(shì)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)以軟脂酸(PA)誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞損傷，觀察其對(duì)eNOS和NO表達(dá)的影響并探討LWDHP含藥血清的干預(yù)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 EA.hy926人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2動(dòng)物 52只SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，雌雄各半，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001)。

1.3主要試劑 LWDHP(濃縮丸)，北京同仁堂(國(guó)藥準(zhǔn)字Z19993068)；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，美國(guó) HyClone 公司；胰島素，PA，Sigma公司；兔抗人eNOS一抗，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗，美國(guó)Proteintech Group公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，Cell Signaling Technology公司；RT-PCR試劑盒，TaKaRa公司；總NO檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；二甲雙胍(MET)，上海生工生物工程有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4六味地黃丸含藥血清的制備 大鼠分籠喂養(yǎng)，每籠5～6只，晝夜自然采光，室溫16℃～25℃，相對(duì)濕度60%～70%，早晚各喂食1次，換水1次/d，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字法分為兩組，34只為正常對(duì)照組，18只為L(zhǎng)WDHP中藥組。中藥組給予LWDHP粉末水溶液(生藥質(zhì)量濃度為15 g·kg-1·d-1灌胃，3 ml/次/只，2次/d，正常對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d。于第6天末次給藥1～2 h后10%水合氯醛腹腔麻醉(1.5 ml/只)，打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈采血，血液自然凝固后分離血清，56℃滅活30 min，過(guò)濾除菌，分裝，封口，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5測(cè)定細(xì)胞裂解液NO含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整密度為0.5×105個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μl/孔，分為正常對(duì)照組，PA組，LWDHP中藥組(2.5%、5%、10%含藥血清)，MET組，每組6個(gè)復(fù)孔，于37℃，5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞90%生長(zhǎng)融合后，LWDHP治療組換成不同濃度梯度含大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，MET組加入MET(終濃度2 mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入PA(終濃度為400 μmol/L)孵育1 h后，再加入胰島素(終濃度50 nmol/L)。PA作用細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入0.1 ml的RIPA裂解液(含10 μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF)，1 600 r/min離心10 min取上清液，按照檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，于540 nm測(cè)定光密度值，檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中NO含量。

1.6RT-PCR測(cè)定細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá) 將細(xì)胞按5×105個(gè)/ml 密度接種到25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶加4 ml培養(yǎng)基，分成正常對(duì)照組，PA組，5%LWDHP含藥血清治療組，MET組。各組細(xì)胞藥物處理同1.5，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定OD260和OD280的比值以鑒定RNA純度。隨后用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)。

肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物序列：5′-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3′，下游引物序列：5′-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度153 bp。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)。eNOS上游引物序列：5′-GACATTGAGAGCAAAGGGCTG-3′，下游引物序列：5′-CGGCTTGTCACCTCCTGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度408 bp。反應(yīng)條件：退火62℃，35個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以eNOS條帶光密度值和對(duì)應(yīng)的β-actin條帶光密度值的比值表示eNOS mRNA的表達(dá)量。

1.7Western印跡測(cè)定細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組同1.6，加藥處理同1.5，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度。調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量(40 μg)，SDS-PAGE電泳分離，半干電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃水浴震蕩封閉1 h，加入eNOS一抗(1∶500稀釋)，4℃過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗3次，5 min/次，HRP標(biāo)記IgG二抗(1∶2 000稀釋)，TBST清洗4次，5 min/次，37℃水浴震蕩2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，掃描條帶，ImageJ2x軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參，eNOS和GAPDH蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行灰度比值顯示eNOS相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞上清液NO含量 PA損傷的細(xì)胞裂解液中NO含量減少(207.42±19.03)，與正常對(duì)照組(319.24±14.38)比較差異顯著(P<0.01)。2.5%LWDHP含藥血清組NO含量(205.23±9.52)進(jìn)一步減少。5%、10%LWDHP含藥血清組(297.13±8.45、303.12±12.78)及MET組(306.10±13.85)均能顯著增加細(xì)胞裂解液中NO含量，與PA組比較差異顯著(P<0.01)，但三者間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2各組eNOS mRNA的表達(dá) PA組細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA的表達(dá)量(0.11±0.005)顯著減少，與正常對(duì)照組(1.36±0.008)比較差異顯著(P<0.01)。LWDHP組(0.19±0.005)和MET組(0.91±0.011)細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA表達(dá)量增加，與PA組比較差異顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.3各組eNOS 蛋白的表達(dá) PA組細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白的表達(dá)量顯著減少(0.35±0.006)，與正常對(duì)照組(0.44±0.003)比較差異顯著(P<0.01)。LWDHP組(0.54±0.016)和MET組(0.55±0.004)細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)量明顯增加，與PA組比較差異顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組EA.hy926細(xì)胞內(nèi)eNOS mRNA的表達(dá)比較

圖2 各組EA.hy926細(xì)胞內(nèi)eNOS 蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

目前認(rèn)為IR是T2DM重要的病理基礎(chǔ)之一。IR是指胰島素作用的靶細(xì)胞如脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞等對(duì)正常濃度的胰島素產(chǎn)生了敏感性下降的現(xiàn)象，生物學(xué)反應(yīng)低于正常水平，從而使葡萄糖的利用減少，引起血糖水平升高，繼而促發(fā)胰島素代償性增多，表現(xiàn)為高胰島素血癥〔6〕。

血管EC是覆蓋在血管腔內(nèi)表面的高度分化的單層細(xì)胞，是血管壁和血液之間的分界細(xì)胞，正常的EC不僅是血液和血管平滑肌之間的半透屏障，而且還是一個(gè)非?；钴S的代謝和內(nèi)分泌器官。正常水平的胰島素對(duì)維持血管內(nèi)皮功能起著關(guān)鍵作用，胰島素可增強(qiáng)EC的eNOS表達(dá)，eNOS為NO生成反應(yīng)中的主要限速酶，催化血管內(nèi)皮釋放NO〔7〕。NO 是研究最為詳盡且被廣泛公認(rèn)的反映內(nèi)皮功能變化的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之一，它是一種內(nèi)皮源性信號(hào)分子，能激活血管平滑肌細(xì)胞中的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，引起內(nèi)皮依賴性舒張功能，介導(dǎo)血管舒張，促進(jìn)血液中胰島素穿過(guò)毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障作用于靶組織，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。因此說(shuō)NO是一種血管保護(hù)因子〔8〕。

IR時(shí)主要是使血管內(nèi)皮的NO合成系統(tǒng)受損，損害血管EC產(chǎn)生的eNOS，使NO合成減少，EC失去正常的生理狀態(tài)，導(dǎo)致ECD的發(fā)生，出現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)功能障礙，所以組織和細(xì)胞對(duì)胰島素的攝取和利用能力下降與ECD往往是同時(shí)存在〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PA可通過(guò)抑制EC eNOS的表達(dá)，從而減少NO的釋放，導(dǎo)致ECD。

目前治療IR的藥物主要是以MET為代表的雙胍類藥物，但均有一定程度的局限性及較多的不良反應(yīng)和副作用，不能長(zhǎng)期服用。因此尋找多靶向、副作用小的中藥治療IR及DM越來(lái)越得到人們的重視。近年多項(xiàng)研究表明，中藥在預(yù)防EC損傷，保護(hù)EC方面具有較為理想的調(diào)控效果〔10〕。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為DM主要由氣陰兩虛所致，陰虛和久病傷氣是糖尿病的基本病理變化，而血脈循環(huán)又必須建立在陰津充足，氣行正常的基礎(chǔ)上，所以氣虛陰虧是DM的基本病因病機(jī)〔11〕。LWDHP是滋補(bǔ)氣陰兩虛的傳統(tǒng)名方，被譽(yù)為“補(bǔ)陰方藥之祖”，臨床上用以治療DM凸顯出其優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的六味地黃丸含藥血清對(duì)PA損傷的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)保護(hù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇5%LWDHP含藥血清作為最佳治療濃度。提示LWDHP能通過(guò)增加eNOS的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)NO的釋放，證明LWDHP在一定程度上可以預(yù)防EC的損傷，改善受損的內(nèi)皮功能狀態(tài)。綜上，LWDHP能干預(yù)保護(hù)PA誘導(dǎo)EA.hy926EC的損傷，為L(zhǎng)WDHP治療DM和IR提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并開(kāi)辟更廣闊的應(yīng)用前景。

4 參考文獻(xiàn)

1Rao PM，Kelly DM，Jones TH.Testosterone and insulin resistance in the metabolic syndrome and T2DM in men〔J〕.Nat Rev Endocrinol，2013；9(8)：479-93.

2Kotlinowski J，Dulak J，Jozkowicz A.Type 2 diabetes mellitus impairs endothelial progenitor cells functions〔J〕.Postepy Biochem，2013；59(3)：257-66.

3Hoang HH，Padgham SV，Meininger CJ.L-arginine，tetrahydrobiopterin，nitric oxide and diabetes〔J〕.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2013；16(1)：76-82.

4Muhammad SA，Bilbis LS，Saidu Y，etal.Effect of antioxidant mineral elements supplementation in the treatment of hypertension in albino rats〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2012；2012：134723.

5沈世林，張汝學(xué)，賈正平.中藥治療2型糖尿病的現(xiàn)狀及其展望〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2007；22(4)：230-2.

6Winkler G，Cseh K.Molecular mechanisms and correlations of insulin resistance，obesity，and type 2 diabetes mellitus〔J〕.Orv Hetil，2009；150(17)：771-80.

7Kohlhaas CF，Morrow VA，Jhakra N，etal.Insulin rapidly stimulates L-arginine transport in human aortic endothelial cells via Akt〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2011；412(4)：747-51.

8Katusic ZS，Austin SA.Endothelial nitric oxide：protector of a healthy mind〔J〕.Eur Heart J，2013〔Epub ahead of print〕.

9Zecchin HG，Priviero FB，Souza CT，etal.Defective insulin and acetylcholine induction of endothelial cell-nitric oxide synthase through insulin receptor substrate/Akt signaling pathway in aorta of obese rats〔J〕.Diabetes，2007；56(4)：1014-24.

10徐娟萍，張曉峰.氧化低密度脂蛋白致血管內(nèi)皮損傷機(jī)制及中藥復(fù)方防治的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代藥物與臨床，2011；26(3)：195-8.

11仝小林，柳紅芳.糖尿病早期“六郁”病機(jī)探討〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007；30(7)：447-9.