張泓波 高維娟 錢 濤 唐敬龍 李 君

(承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

腦缺血再灌(I/R)注既可挽救瀕死的細胞，又可加重缺血細胞的損傷，引起腦缺血再灌注損傷〔1〕而導致癡呆。學習和記憶中樞位于海馬，CA1區(qū)是腦缺血再灌注損傷的敏感區(qū)域。環(huán)磷酸腺苷反應(cAMP)元件結(jié)合蛋白(CREB)是細胞核內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵調(diào)節(jié)子，可調(diào)控多種基因的表達，具有調(diào)節(jié)包括學習在內(nèi)的廣泛的生物學功能〔2〕。本研究通過觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后學習記憶能力、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的改變和海馬組織CREB 及其效應蛋白CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)的DNA結(jié)合活性變化，探討腦缺血再灌注致血管性癡呆(VD)學習記憶障礙的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年SPF級SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號：SCXK(京)2007-0001〕。CREB及C/EBP寡聚核苷酸探針(上海英俊生物工程有限公司)；核蛋白抽提試劑盒(美國Pierce公司)；EMSA試劑盒(德國Roche公司)；帶正電荷的尼龍膜(美國Pall公司)；戊巴比妥鈉(德國)。

1.2方法

1.2.1動物分組及造模 用水迷宮將大鼠進行定位航行實驗和空間探索實驗，根據(jù)Nature Protocols推薦的標準〔3〕篩選出4只空間學習和記憶水平較差的大鼠后按體質(zhì)量差異隨機數(shù)字表法分為假手術組和腦缺血再灌注損傷模型組，每組22只。模型組：戊巴比妥鈉(50 mg/kg)行腹腔麻醉后采用四血管阻斷(4-VO )方法〔4〕制備I/R大鼠模型。將大鼠行背側(cè)頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動脈，造成永久性閉塞。24 h后將大鼠麻醉，行腹側(cè)頸正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min，共3次，每次間隔1 h。假手術組：只做皮膚切口和組織分離處理，不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。各組飼養(yǎng)30 d。

1.2.2水迷宮檢測學習記憶能力 第25～30天，對大鼠進行水迷宮試驗。去除手術死亡者，各組大鼠20只為最終統(tǒng)計對象。以手術后第29天大鼠逃避潛伏期(將大鼠從入水點面向池壁置入水槽中，記錄90 s內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺所需的時間)的平均成績作為學習成績；術后第30天大鼠空間探索次數(shù)(撤去平臺，將大鼠從第二象限入水點放入水槽，記錄60 s內(nèi)其經(jīng)過平臺象限的次數(shù))的平均成績作為記憶成績。逃避潛伏期越短、跨越臺次數(shù)越多，學習記憶能力越強。

1.2.3HE染色觀察神經(jīng)元形態(tài)改變 每組大鼠中隨機選取6只，1 g/L戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織。石蠟包埋，冠狀切片，制成4 μm厚連續(xù)切片HE 染色,光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學改變。切片采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進行定量分析：在10×40倍顯微鏡下，每張切片選6個不同子午線方向視野行各層細胞計數(shù)，取平均值。

1.2.4電泳遷移率改變分析法(EMSA)測定CREB和C/EBP的DNA結(jié)合活性 將各組大鼠迅速斷頭處死，在低溫修塊臺上分離出雙側(cè)海馬組織。稱重剪碎，勻漿棄上清。按核蛋白提取試劑盒提供的操作規(guī)程提取核蛋白。用BCA法進行蛋白定量后-80℃保存。設計CREB DNA結(jié)合序列 ：5′-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGAGCTAG-3′；C/EBP DNA結(jié)合序列5′-GATCAAGCTGCAGATTGCGCAAT -3′。探針標記參照DIG Gel Shift Kit操作手冊進行。標記反應結(jié)束后調(diào)整探針濃度為15.5 pmol/L。取各樣本核蛋白4 μg與標記的寡核苷酸探針2 μl 25℃孵育15 min。采用6%非變性聚丙烯酰凝膠4℃ 80V電泳分離DNA-核蛋白結(jié)合體。電泳完畢將DNA-核蛋白結(jié)合體轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜，化學發(fā)光法檢測特異性條帶。經(jīng)曝光、顯影和定影后將圖像掃描至電腦，用Quantity one4.4凝膠分析軟件對特異結(jié)合條帶凈灰度值進行采集。凈灰度值代表轉(zhuǎn)錄因子與特定DNA的結(jié)合強度和活性。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學習記憶能力的比較 與假手術組比較，模型組逃逸潛伏期明顯延長〔(41.3±1.8) vs (23.41±1.1)s,P<0.05〕，跨越平臺次數(shù)明顯減少〔(5.3±0.6)vs(8.0±1.0)次，P<0.05〕。

2.2各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目的改變 假手術組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、均勻，細胞結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)消失，胞核區(qū)域濃染，出現(xiàn)凝固性壞死及細胞脫失，正常神經(jīng)細胞數(shù)目(16.33±1.08)較假手術組明顯減少(48.56±3.23，P<0.05)。見圖1。

2.3各組大鼠海馬組織CREB的DNA結(jié)合活性變化 經(jīng)EMSA檢測,各組大鼠海馬組織核提取物均有與預先設計的CREB DNA序列的結(jié)合：與假手術組比較(612.50±43.56)，模型組大鼠海馬組織CREB的DNA結(jié)合活性顯著降低(142.25±27.86，P<0.01)。見圖2。

圖1 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)(HE，×400)

圖2 大鼠海馬CREB的DNA結(jié)合活性比較

2.4各組大鼠海馬組織C/EBP DNA結(jié)合活性的影響 經(jīng)EMSA檢測，各組大鼠海馬組織核提取物均有與預先設計的C/EBP DNA序列的結(jié)合：與假手術組(1 218±37.15)比較，模型組大鼠海馬組織C/EBP的DNA結(jié)合活性顯著降低(97.00±5.88，P<0.01)。見圖3。

圖3 大鼠海馬C/EBP的DNA結(jié)合活性比較

3 討 論

VD的病理生理學機制包含多個快速的級聯(lián)反應，如免疫炎癥反應、興奮性氨基酸釋放增加、細胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)等，這些環(huán)節(jié)互為因果形成惡性循環(huán)最終導致細胞凋亡或壞死〔5〕，其功能表現(xiàn)之一為認知功能下降。核轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化后可結(jié)合于基因啟動子上游cAMP反應單元(cAMP response element,CRE)的DNA結(jié)合序列，提高下游基因如即早基因(IEGs)c-fos、c-jun、c/reb等的表達。目前CREB已被確定為影響記憶存儲的關鍵蛋白〔6〕，可調(diào)節(jié)長時程增強(LTP)和突觸可塑性相關的基因轉(zhuǎn)錄。本實驗證實VD大鼠空間學習記憶障礙可能與海馬區(qū)CREB -DNA結(jié)合活性下降相關。此外，CREB對腦缺血再灌注損傷可發(fā)揮保護作用。例如鹽酸美金剛(NMDA受體的拮抗劑)，堿性成纖維細胞生長因子均可以通過不同途徑活化CREB從而減少缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡〔7，8〕。CREB可增強抗凋亡蛋白Bcl-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子BNDF等的表達,參與缺血損傷后神經(jīng)元的再生、存活及修復過程〔9，10〕。模型組神經(jīng)元損傷可能與谷氨酸NMDA受體興奮毒性、鈣超載引起的神經(jīng)毒性減少了CREB與DNA結(jié)合相關〔11，12〕。

本實驗發(fā)現(xiàn)模型組學習記憶功能下降的同時還出現(xiàn)了C/EBP-DNA結(jié)合活性的下降。C/EBP是IEGs的產(chǎn)物，它進一步激活晚期反應基因的表達，編碼長期調(diào)節(jié)突觸功能所必需的蛋白質(zhì)。C/EBPβ在新記憶的永久化過程中具有促進作用〔13〕。關于c/EBPs在腦缺血再灌注損傷中的作用還有待進一步探討。有研究表明，C/EBPβ可介導缺血后的大腦免疫反應和神經(jīng)元損傷〔14〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志，C/EBP同源蛋白(CHOP)在大鼠局灶性腦缺血再灌注皮質(zhì)和海馬中均可誘導表達，在缺血再灌注所致的神經(jīng)細胞凋亡中可能發(fā)揮重要作用〔15，16〕。在慢性腦低灌注狀態(tài)下，C/EBP-DNA結(jié)合活性與大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的關系尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷30 d后，模型組大鼠海馬C/EBP活性相對于假手術組下降，機制可能為CREB-DNA結(jié)合活性的下降影

響了C/EBP的表達，從而降低了后者的活性。但其靶基因為何，是否和短暫的腦缺血再灌注中發(fā)揮的作用相似，c/EBPs家族成員的功能是否一致，尚需進一步研究。本實驗C/EBP-DNA結(jié)合活性與神經(jīng)元損傷變化趨勢相反，可能是缺血再灌注的早期反應基因調(diào)節(jié)參與了神經(jīng)細胞的存亡，晚期調(diào)節(jié)反應基因與組織修復和功能恢復有關。

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