王 瓊 李惠勉

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部病房，河南 鄭州 450014)

糖尿病(DM)是腦血管病的重要危險因素，其發(fā)生缺血性腦卒中的危險性高〔1〕，DM腦血管病在大血管及微血管上均有累及，資料顯示DM性腦血管病是由高血糖、蛋白質(zhì)非酶糖化、血脂代謝紊亂、血液流變學(xué)異常、血小板功能異常等相關(guān)因素所致〔2〕。目前國內(nèi)外在心、肺、肝、腎及視網(wǎng)膜等臟器的血管重塑方面研究較多，而對DM引起的腦血管重塑方面的研究甚少。氨基胍(AG)是一種糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)拮抗劑，它可以明顯抑制AGEs的生成，改善高血糖、血脂所引起的血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。Baicalein是中藥黃芩的主要提取物，具有抗氧化、抑制血管平滑肌增生等作用。本實驗通過建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，應(yīng)用AG和Baicalein對DM大鼠進行干預(yù)，探討二者對DM大鼠腦微血管結(jié)構(gòu)重塑的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器 8～9周齡SD大鼠48只，體重180～200 g(鄭州大學(xué)實驗動物中心)，鏈脲佐菌素(STZ)和AG(美國sigma公司)，Baicallein(上?？笊锛夹g(shù)有限公司)，One-Touch-Ⅱ型血糖儀及試紙(美國強生公司)，JEM-100SX透射式電子顯微鏡(日本日立公司茨城縣NAKA工廠，西安交通大學(xué)電鏡室提供)，CD34鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉生物工程公司)。

1.2DM動物模型的制備及分組 48只SD大鼠隨機分為AG組、Baicalein組、DM組、對照組，每組12只，對照組給予普通飲食喂養(yǎng)； 其余三組按照文獻〔3〕建立DM大鼠模型，AG組、Baiclien組、DM組給予高脂高糖飲食(10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽鹽，66.5%普通飼料)喂養(yǎng)，6 w后，AG組、Baicalein組及DM組大鼠禁食不禁水12 h后，于左下腹部腹腔注射30 mg/kg STZ溶液(臨用前用0.1 mol/L，pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成2%的溶液，避光進行，現(xiàn)配現(xiàn)用)，對照組腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液，72 h后尾靜脈采血，用OnETOUcH血糖儀測定血糖，以隨機非空腹血糖>16.7 mmol/L定為DM模型，造模成功后，AG組、Baicalein組分別給予AG溶液、Baicalein溶液灌胃，劑量均為150 mg·kg-1·d-1，DM組，對照組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均飼養(yǎng)16 w，檢測血糖、觀察病情。

1.3電鏡觀察 16 w末，各組大鼠用10%水合氯醛(250 mg/kg)腹腔注射麻醉，開胸，用穿刺針小心插入左心室，同時剪開右心耳，生理鹽水10 ml經(jīng)心臟快速灌注，直至流出液體變清，再用4%多聚甲醛+2.5%戊二醛先快后慢灌注固定30 min，直到大鼠全身僵硬為止，開顱取出全腦，去掉腦干和小腦，取大腦皮層中部，切成1 mm3的組織塊，立即置于2.5%的戊二醛固定液中4℃固定，1%四氧化鋨固定液4℃后固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，聚合后作半超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射式電子顯微鏡(×30 000)下觀察、拍照。

1.4CD34免疫組化染色及微血管計數(shù) 大鼠腦組織取材方法同電鏡，取出全腦，去掉腦干和小腦后，4%多聚甲醛固定8 h，常規(guī)石蠟包埋切片，磷酸鹽緩沖液PBS沖洗3次，浸泡5 min/次，室溫滴加3%H2O220 min，PBS沖洗3次，5 min/次， SP試劑盒說明書進行操作，一抗(CD34,1∶100)DAB顯色，鏡下控制顯色時間，梯度酒精脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片。微血管密度計數(shù)方法：參照Weidener〔4〕等的計數(shù)方法，每張切片隨機選取5個高倍(×200)視野下進行微血管計數(shù)，計算每平方毫米面積內(nèi)的微血管數(shù)量，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠微血管透射電鏡觀察結(jié)果 對照組毛細血管腔規(guī)則，細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁可見；基底膜結(jié)構(gòu)清晰。DM組毛細血管形態(tài)不規(guī)則，部分血管管腔狹窄、變形，血管周圍膠質(zhì)細胞腫脹、溶解，血管內(nèi)皮細胞腫脹，細胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集、邊集，核仁少見；細胞質(zhì)內(nèi)細胞器較少，線粒體腫脹，呈空泡樣改變，基底膜結(jié)構(gòu)不清晰。AG組毛細血管腔內(nèi)空曠，結(jié)構(gòu)完整，部分血管形態(tài)不規(guī)則，血管內(nèi)皮細胞輕度腫脹，基底膜結(jié)構(gòu)略清晰；細胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，部分細胞內(nèi)及細胞間可見大量空泡。Baicalein組血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞核呈卵圓形，核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集；其基底膜結(jié)構(gòu)完整，血管周圍可見膠質(zhì)細胞，神經(jīng)細胞仍有腫脹，細胞核呈圓形，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，核仁明顯；細胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹。見圖1。

2.2各組大鼠CD34免疫組化檢測結(jié)果 AG組〔(22.45±3.05)個〕、Baicalein組〔(23.9±2.42)個〕、DM組〔(18.7±2.87)個〕與對照組〔(25.8±2.48)個〕比較，前三組CD34表達微血管數(shù)量減少(P<0.01),DM組CD34表達的微血管數(shù)較AG、Baicalein兩組明顯減少(P<0.01)；AG、Baicalein兩組比較，CD34表達微血管數(shù)無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠透射電鏡下腦組織微血管形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)(×30 000)

圖2 各組大鼠腦血管CD34免疫組化表達(×200)

3 討 論

DM性腦血管病是因DM引發(fā)的腦血管病，在糖、脂肪、蛋白質(zhì)等一系列代謝紊亂的基礎(chǔ)上，所引起的顱內(nèi)大血管和微血管病變〔5〕。血管壁可以感知周圍環(huán)境的變化，并對刺激做出反應(yīng)，調(diào)節(jié)其管壁下生物學(xué)行為以維持血管功能的平衡，若平衡被打破，可造成血管結(jié)構(gòu)的改變，即發(fā)生“血管重塑”〔6〕。DM血管重塑包括：①血管內(nèi)膜下間隙和中層細胞總體積及細胞外基質(zhì)(ECM)增加造成的，稱為生長；②血管總體積不變，但組成成分重新排列導(dǎo)致血管內(nèi)外徑縮小，血管壁增厚，把這種現(xiàn)象的重構(gòu)稱為嚴格意義上的重塑〔7〕。DM血管重塑既是DM血管的病理改變，又是發(fā)生血管并發(fā)癥如動脈粥樣硬化及微血管病變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。影響DM血管重塑因素很多，其中，在高血糖環(huán)境下與體內(nèi)不同蛋白質(zhì)在非酶解作用下形成AGEs的異常作用是血管重塑影響因素中主要因素之一〔8,9〕，AGEs主要通過與其特異性AGE受體(RAGE)結(jié)合，啟動MAP激酶(MAPK)及核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號通路(細胞增殖與炎癥)、Ras通路(應(yīng)激與細胞凋亡)、Rac/Cdc42通路(細胞生長與運動)以及Jak/Stat通路(基因表達調(diào)控)等〔10〕，上調(diào)多種生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、堿性成纖維生長因子(bFGF)等，黏附分子如細胞間黏附分子(ICAM)-1等以及纖溶酶原活化抑制因子(PAI)-1等基因的表達〔11〕,促進細胞增殖，血管通透性增加，內(nèi)皮素的形成，增加Ⅳ型膠原、蛋白聚糖及纖維的合成，導(dǎo)致ECM擴張，血管基底膜增厚，微血管血液瘀滯甚至閉塞等血管病變。此外AGEs可造成分子重排、參與氧化應(yīng)激等多種機制引起血管損傷和功能的改變〔12〕。

研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞功能障礙的程度與血管重塑的性質(zhì)呈相關(guān)性，在血管重塑的模型中觀察到內(nèi)皮損傷程度越重，管壁增厚，管腔狹窄越明顯。動脈粥樣硬化及血管移植的病人中也發(fā)現(xiàn)了血管重塑與嚴重的內(nèi)皮細胞功能障礙有關(guān)〔13,14〕，即證實血管內(nèi)皮功能障礙越嚴重，預(yù)示血管重塑向負性方向發(fā)展，不利于疾病進程。DM時，內(nèi)皮細胞功能紊亂引起的微血管重塑，與蛋白激酶C(PKC)被激活有關(guān)。PKC是一種重要的細胞內(nèi)信號通路。PKC的激活進一步引起一系列的病理改變： eNOS的活性的降低，一氧化氮(NO)產(chǎn)生和分泌的減少，血管內(nèi)皮素(ET-1)的釋放，引起血管舒縮功能障礙〔15〕；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，新生血管的形成，血管通透性的增強，ICAM-1、血管黏附分子(VCAM-1)和E-選擇素升高，使得白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附增加，加重血栓的形成；TGF-β1的表達水平上調(diào)，增加纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的表達，引起ECM增生。上述因子的改變均可加重微血管重塑，因此選擇敏感的微血管內(nèi)皮細胞標志物，反映微血管重塑的嚴重程度，對微血管重塑的治療尤為重要。CD34又稱人原始造血細胞抗原，是一種高度酸性的Ⅰ型糖基化單鏈跨膜糖蛋白，其分子量為105～120 kD，微血管形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CD34內(nèi)皮細胞抗原在毛細血管、小血管內(nèi)皮細胞呈強陽性，且CD34標記的微血管顯影效果良好，背景染色淺，Hollongsworth等〔16〕認為CD34是目前血管內(nèi)皮細胞最可靠的標志物。因CD34在正常組織中的所有血管內(nèi)皮細胞均有表達且色澤最深，便于微血管數(shù)量的計數(shù)〔17〕，因此，實驗中選擇CD34作為檢測微血管數(shù)量的指標，反應(yīng)微血管損傷的程度，進而判斷腦微血管重塑的嚴重程度。本研究結(jié)果提示CD34表達愈少，微血管數(shù)量減少的愈多，微血管內(nèi)皮細胞受損愈多，微血管重塑愈重。

AG是一種非酶糖基化終產(chǎn)物(AGEs)抑制劑，是一種親核的肼類化合物，可以抑制AGEs的形成。AGEs是長期高血糖引起的糖與蛋白質(zhì)中的氨基發(fā)生非酶糖基化產(chǎn)生的，經(jīng)糖基化修飾的蛋白質(zhì)發(fā)生功能性的改變，使得血管基底膜發(fā)生變構(gòu)，直接損傷血管內(nèi)皮，促進平滑肌細胞的增殖，加快血小板聚集和血栓形成。研究〔18〕表明,AG可以抑制AGEs的形成，在延緩DM腎病、DM視網(wǎng)膜病變、蛋白尿等都顯示出良好的療效。本實驗中應(yīng)用AG對DM大鼠進行了干預(yù)，電鏡觀察結(jié)果提示AG可以減輕腦微血管結(jié)構(gòu)的損傷，減輕血管狹窄，抑制微血管重塑。免疫組化法結(jié)果提示應(yīng)用AG后，腦組織微血管數(shù)量得到了改善，同時也反映了其對微血管重塑的抑制作用。

Baicalein是中藥黃芩提取的黃酮類化合物，近年來，很多研究發(fā)現(xiàn)這類化合物在抗氧化、抗炎等方面有一定的成效〔19～21〕，本實驗結(jié)果提示Baicalein同樣可在一定程度上減輕DM腦微血管的損害，抑制微血管重塑，因而具有一定的保護腦血管的作用，且Baicalein價格低廉，藥源充足，毒副作用小，故對其進行研究可能具有較大的臨床應(yīng)用價值。

4 參考文獻

1Arboix A，Milian M，Oliveres M，etal.Impact of female gender on prognosis in type 2diabetic patients with ischemic stroke 〔J〕.Eur Neurol，2006；56(1)：6-12.

2Megherbi SE，Milan C，Minier D，etal.Association between diabetes and stroke subtype on survival and functional outcome 3 months after stroke data from the European BIOMED Stroke Project〔J〕.Strok，2003；34(3)：688-94.

3施 紅，金國琴，余文珍.誘導(dǎo)構(gòu)建最佳類似人類2型糖尿病大鼠的造模方法〔J〕.中國臨床康復(fù)，2005；9(39):69-71.

4Weidner N,Semple JP,Welch WR,etal.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma〔J〕.N Engl J Med，1991；324(1):1-8.

5王銘維.糖尿病與腦血管病〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2007；26(8)：567-8.

6Gibbons GH,Dzau VJ.The emerging concept of vascular remodeling〔J〕.N Engl J Med,1994；330(20):1431-8.

7Heagerty AM,Aalkjaer C,Bund SJ,etal.Small artery structure in hypertention:dual processes of remodeling and growth〔J〕.Hypertenstion,1993；21(4):391.

8Vlassara H,Palace MR.Diabetes and advanced glycation endproducts〔J〕.J Interm Med,2002；251(2):87-101.

9Peppa M,Vribarri J,Vlassara H.The role of advanced glycation end products in the development of atherosclerosis〔J〕.Curr Diab Rep,2004；4(1):31-6.

10Hudson BI,Schmidt AM.RAGE:a novel target for drug intervention in diabetic vascular disease〔J〕.Pharm Res,2004；21(7):1079-86.

11Skrha J.Pathogenesis of angiopathy in diabetes〔J〕.Acta Diabetol,2003；40(2):S324-9.

12Yim MB,Yim HS,Lee C,etal.Protein glycation :creation of catalytic sites for free radical generation〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2001；928:48-53.

13Mcleod AL,Newby DE,Northridge DB,etal.Influence of differential vascular remodeling on the coronary vasomotor response〔J〕.Cardiovasc Res,2003；59(2):520-6.

14Schwarzacher SP,Uren NG,Ward MR,etal.Determinants of coronary remodeling in transplant coronary disease:a simultaneous intravascular ultrasound and doppler flow study〔J〕.Circulation,2000；101(12):1384-9.

15Yokota T,Ma RC,Park JY,etal.Role of protein kinase C on the expression of platelet-derived growth factor and endothelin-1 in the retina of diabetic rats and cultured retinal capillary pericytes〔J〕.Diabetes,2003,52(3):838-45.

16Hollingsworth HC,Kohn EC,Steinberg SM,etal.Tumor angiogenesis in advanced stage ovarian carcinoma〔J〕.Am J Pathol，1995;147(1):33-41.

17柏樹令，趙 丹.CD34抗原的生物學(xué)特征及其臨床應(yīng)用〔J〕.解剖科學(xué)進展,2005；11(1):54-6,60.

18Jandeleit-Dahm KA，Lassila M，Allen TJ.Advanced glycation end products in diabetes-associated atherosclerosis and renal disease:interventional studies〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2005；1043:759-66.

19Gao Z,Huang K,Yang X,etal.Free radical scavenging and antioxidant activities of flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis Georgi〔J〕.Biochim Biophys Acta，1999;1472(3):643-50.

20Gao ZH,Huang K,Xu H.Protective effects of Scutellaria baicalensis Georgi against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in HS-SY5Y cells〔J〕.Pharmacol Res，2001;43(2):173-8.

21Nishioka T,Kawabata J,Aoyama Y.Baicalein:an α-glucosidase inhibitor from Scutellaria baicalensis〔J〕.J Nat Prod，1998;61(11):1413-5.