任家謀 官志忠 肖 雁 吳昌學(xué) 齊曉嵐

(貴陽醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

Notch信號通路通過Notch受體與配體結(jié)合，Notch受體經(jīng)過兩次蛋白酶的水解。使其胞內(nèi)域(ICN)釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。ICN在MAML等輔助因子作用下，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。Notch通路與阿爾茨海默氏病(AD)的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，Berezovska〔1〕研究發(fā)現(xiàn)Notch1在散發(fā)型AD患者的海馬的表達(dá)水平是對照組的2倍多。Nagarsheth〔2〕通過免疫組化對腦部海馬區(qū)進(jìn)一步研究表明，與缺乏特征性組織學(xué)改變的癡呆組及對照組比，Notch信號通路的受體Notch1基因在AD患者體內(nèi)表達(dá)升高。nAChR屬于配體門控離子通道耦聯(lián)受體。nAChR與很多大腦功能有關(guān)，在AD發(fā)病中占有重要的作用。通過對AD患者的正電子發(fā)射圖譜(PET)研究發(fā)現(xiàn)，在疾病發(fā)生的早期即出現(xiàn)特異性的尼古丁受體減少，這與AD患者認(rèn)知功能關(guān)系的改變有著密切的關(guān)系〔3〕。研究表明在AD患者的大腦皮層的神經(jīng)型尼古丁受體的含量明顯減少〔4〕。本文旨在研究用DAPT(Notch信號通路的特異性抑制劑)處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，觀察抑制Notch信號通路后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中α3 nAChR基因表達(dá)變化的影響探討Notch信號通路與α3 nAChR的關(guān)系，進(jìn)一步了解 3 nAChR 的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 源于人腦的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y細(xì)胞)購于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司；DMEM培養(yǎng)基，新生胎牛血清，胰蛋白酶均購于美國HyClone公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗，鼠抗α3 nAChR，鼠抗β-actin內(nèi)參均購于美國Santa Cruz公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于立陶宛MBI公司；SYBR Green 染料購于美國Roche公司；細(xì)胞裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購于碧云天生物試劑公司；二甲基亞砜購于美國Gibco公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒購于南京建成生物研究所；PVDF膜，ECL-Plus發(fā)光試劑盒，高效顯影膠片均購于美國Amersham公司；顯影液、定影液均購于柯達(dá)公司；DAPT購于美國Sigma試劑公司。α3 nAChR基因的引物和βactin內(nèi)參引物序列均有上海生工設(shè)計(jì)并合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)液的成分：DMEM培養(yǎng)基，10%滅活胎牛血清，1%雙抗(青霉素100 U/ml,鏈霉素100 U/ml)。37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞分為正常對照組，DMSO組，DAPT組。用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，改用不含血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入4 μl的濃度為5 mmol/L的Notch信號通路抑制劑DAPT(用DMSO溶解)使其終濃度為10 mmol/L，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2α3 nAChR mRNA的表達(dá)水平的檢測 將收集之后的細(xì)胞用Trizol一步法提取RNA，用核酸蛋白定量儀定量之后，選取OD260/280為1.9～2.1的。根據(jù)其定量的濃度取3 μl的RNA提取液用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄之后cDNA放在-40℃保存。設(shè)計(jì)α3 nAChR和內(nèi)參 β-actin 引物(引物序列表1)，用 Real Time-PCR 的方法測定 α3 nAChR的 mRNA 的水平。ABI Step One型實(shí)時熒光定量 PCR 儀采集待測基因及內(nèi)參照 β-actin 擴(kuò)增各 40 個循環(huán)熒光信號，以 Applied Biosystems SDS1.4 軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。SDS1.4 軟件分析其 △△Ct 值及 RQ (relative quantity) 值，RQ=2-△△Ct。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時以β-actin為內(nèi)對照，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組間3 nAChR mRNA和對照組的相對水平。 反應(yīng)條件為：95℃ 10 min,95℃ 15 s；60℃ 60 s，40個循環(huán)95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表1 引物序列表

1.2.3α3 nAChR蛋白水平的檢測 將收集之后的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解(60 μl/孔)，在4℃離心30 min后提取蛋白質(zhì)，將提取的蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒定量后分裝到已經(jīng)高壓過的1.5 ml的EPP管中放入-80℃保存。用Western印跡方法檢測 3 nAChR 亞單位、Notch 1 蛋白表達(dá)水平。12% SDS-PAGE 電泳，每孔上樣量為 30 μg。樣品分離后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5% 牛奶室溫封閉1 h，TBS-T 漂洗，加入相應(yīng)一抗 4℃孵育過夜，TBS-T漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，TBS-T漂洗后ECL顯影，暗室壓片曝光。以Labworks軟件分析結(jié)果時以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算蛋白條帶與β-actin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為蛋白質(zhì)表達(dá)的相對水平比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS11.5 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)水平 SH-SY5Y+DMSO組(1.1±0.04)與SH-SY5Y空白細(xì)胞組(1.0±0.03)相比較，SH-SY5Y+DMSO組中Notch1蛋白水平?jīng)]有變化。SH-SY5Y+DMSO+DAPT組(0.2±0.18)與SH-SY5Y對照組相比較，SH-SY5Y細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)水平降低明顯(P<0.01)。

2.2α3 nAChR蛋白表達(dá)水平 SH-SY5Y+DMSO組(1.13±0.2)與SH-SY5Y空白細(xì)胞組(1.0±0.16)相比較，人SH-SY5Y細(xì)胞中的α3 nAChR蛋白水平升高不是很明顯。SH-SY5Y+DMSO+DAPT組(2.0±0.038)與SH-SY5Y空白細(xì)胞組相比較，人SH-SY5Y細(xì)胞中的α3 nAChR蛋白水平升高(P<0.01)。

2.3α3 nAChR mRNA表達(dá)水平 SH-SY5Y+DMSO組(1.04±0.15)與SH-SY5Y空白細(xì)胞組(1.0±0.13)相比較，人SH-SY5Y細(xì)胞中的α3 nAChR mRNA水平升高明顯(P<0.01)。SH-SY5Y+DMSO+DAPT組(5.1±0.3)與SH-SY5Y空白細(xì)胞組相比較，人SH-SY5Y細(xì)胞中的α3 nAChR mRNA水平升高明顯(P<0.01)。

3 討 論

使用Notch信號通路的抑制劑DAPT可有效地阻斷Notch信號通路的傳導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)說明 Notch 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化可能與神經(jīng)細(xì)胞 α3 nAChR的正常分泌及膽堿能信號傳遞密切相關(guān)，這是否與 AD 病人記憶受損有關(guān)將做進(jìn)一步研究。

Notch信號通路是通過“蛋白水解一核轉(zhuǎn)運(yùn)”模式進(jìn)行信號傳遞的〔6〕。Notch受體與配體結(jié)合后，受體分子的S2和S3兩個位點(diǎn)進(jìn)行兩次連續(xù)的切割S2的切割由ADAM樣蛋白酶在細(xì)胞膜外進(jìn)行，進(jìn)而暴露跨膜區(qū)的S3位點(diǎn)。S3由γ-分泌酶切割后，Notch受體釋放其可溶性、具有活性的胞內(nèi)域NICD(NICD轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)并產(chǎn)生物學(xué)作用。Notch受體已經(jīng)被證實(shí)是γ-分泌酶的一種底物，Notch信號通路被抑制后Notch受體被抑制，則γ-分泌酶的表達(dá)減少。γ-分泌酶是引起AD發(fā)病密切相關(guān)的酶即β淀粉樣蛋白(Aβ)的代謝需要3種關(guān)鍵酶之一。APP由α分泌酶水解Aβ區(qū)域內(nèi)部Lys16-Leu17之間的肽鍵，產(chǎn)生分泌型的APP和C83片段，而C83片段又在γ-分泌酶的作用下產(chǎn)生較小的具有神經(jīng)毒性作用的P3和胞內(nèi)片段AICD，此為非淀粉樣肽源性途徑〔7〕。而淀粉樣肽源性途徑則是由β-分泌酶裂解APP分子β部位的第一個氨基酸之前的肽鍵產(chǎn)生分泌型的APP(sAPPα)和C99片段，再由γ-分泌酶切開C99片段中39～44之間的肽鍵，產(chǎn)生不溶性的完整的Aβ1～42/43，含有39～43個氨基酸〔8〕。在AD的發(fā)病密切相關(guān)的Aβ的代謝的后半本分則是由γ-分泌酶的作用產(chǎn)生不溶性的完整的Aβ1～42/43。因?yàn)镹otch通路的抑制引起γ-分泌酶的表達(dá)減少，從而使SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ1～42/43的表達(dá)量減少。

由以上的分析可以得出Notch信號通路阻斷之后γ-分泌酶的表達(dá)減少進(jìn)而導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ1～42/43的表達(dá)量減少。同時研究已經(jīng)證實(shí)α3 nAChR基因沉默之后，SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ1～42/43的表達(dá)量升高〔9〕，那么在SH-SY5Y細(xì)胞中Notch信號通路阻斷之后則Real Time PCR和Western印跡結(jié)果表明α3 nAChR基因的表達(dá)量在mRNA和蛋白水平都升高可能是由于SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ1～42/43的減少而產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)的作用，或者是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)其他的信號通路的相互作用，對此相關(guān)問題再進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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3肖 雁，齊曉嵐，官志忠，等.洛伐他汀對PC12神經(jīng)細(xì)胞中α7尼古丁受體的上調(diào)作用及其神經(jīng)保護(hù)作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2007；27(2):924-6.

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9唐 智，安 宇，齊曉嵐，等.SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中尼古丁受體α3亞單位基因表達(dá)抑制與APP代謝的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009；29(21):2749-51.