王海艷 朱志兵

( 德州市人民醫(yī)院,山東 德州 253000)

冬凌草甲素(oridonin)，別名冬凌草素、延命草寧，是冬凌草的主要有效成分，為四環(huán)二萜類化合物。研究表明，冬凌草甲素對多種腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制或殺傷作用，具有明顯的細(xì)胞毒作用和較強的抗腫瘤活性〔1〕，冬凌草甲素對 20 余種人癌細(xì)胞株生長均有明顯的直接抑制作用〔2〕，對多種腫瘤細(xì)胞如白血病細(xì)胞 NB4〔3〕、肝癌細(xì)胞 HepG2〔4〕、膀胱癌細(xì)胞MB49〔5〕、黑色素瘤細(xì)胞 A357-S2〔6〕等的增殖具有明顯抑制作用。 我們前期工作表明冬凌草甲素對人肝癌HepG2 細(xì)胞具有生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用〔4〕。本課題在前期研究基礎(chǔ)觀察不同濃度的冬凌草甲素誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯和作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 冬凌草甲素購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司(純度≥98%)，用DMSO 溶解(濃度≤0.1%) ；DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；小牛血清(美國Gibco公司)；H2AX(1∶100；Cell Signalling)，γ-H2AX(1∶100；Cell Signalling)，Phos-S1981ATM(1∶100；Cell Signalling)，anti-p53(FL-353 at 1 μg/ml,Santa Cruz); anti-phospho-p53(S15) (1∶1 000,Cell Signaling)；anti-ATM (1∶500，Rockland), anti-phosph-CHK2 (T68) (1∶500，Cell Signalling), anti-CHK2 (1∶1 000，Cell Signalling),辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶1 000，SantaCruz Biotechnology 公司)； β-actin(美國 Santa Cruz公司)； RNA酶、PI染液(美國Sigma 公司)。

1.2細(xì)胞系 人肝癌HepG2細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞接種于含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3Western印跡檢測 p53、Cyclin A、 H2AX蛋白表達(dá) 不同濃度的冬凌草甲素(0、16、32、64 μmol/L)處理HepG2 細(xì)胞48 h 后， 收集2×106/ml細(xì)胞，總蛋白的提取用賽百勝公司的 Protein Extraction solution，并且用Bradford方法定量蛋白質(zhì)。上樣前取 20 μg 等量蛋白質(zhì)加上等體積 2×上樣緩沖液，于 95℃變性10 min后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后，恒流260 mA，90 min 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上，然后用含 5% BSA 的 TTBS 室溫封閉 1 h，進(jìn)行一抗孵育，將一抗按照推薦濃度溶于封閉液中,與對應(yīng)膜共同封閉在塑料袋中, 4℃下過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST(TBS+0.1% Tween20)漂洗膜4次，每次15 min。再使用對應(yīng)的二抗孵育,按照相應(yīng)比例稀釋(1∶1 000),室溫輕搖1 h，二抗孵育結(jié)束后，再用TBST漂洗膜4次，每次15 min。最后使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光顯色法對膜進(jìn)行顯色曝光。

1.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期改變 不同濃度(16、32、64 μmol/L)冬凌草甲素處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞,冰PBS洗2次,用70%冰乙醇4℃固定1 h,冰PBS洗2次,用3 ml PBS重懸細(xì)胞加入RNA酶至終濃度為100 μg/L,37℃水浴30 min，加入PI至終濃度為50 μg/L,4℃避光30 min， 流式細(xì)胞儀上機，488 nm 波長激發(fā)檢測細(xì)胞周期并分析。重復(fù)試驗3次。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡結(jié)果 不同濃度的冬凌草甲素處理HepG2 細(xì)胞48 h后，Western印跡結(jié)果表明，隨著濃度的增加，Phos-S1981ATM、anti-phosph-CHK2 (T68)、anti-phosph-CHK2(T68)、Phos-p53和γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢(見圖1)。

圖1 Western 印跡結(jié)果

2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果 不同濃度的冬凌草甲素(0、 16、32、64 μmol/L)處理HepG2 細(xì)胞48 h后，G2/M 期細(xì)胞比例分別為16.03%、26.01%和46.95%,呈逐漸增多趨勢,而G0/G1期細(xì)胞呈相對減少趨勢。16、32和64 μmol/L 冬凌草甲素組G2/M 期細(xì)胞比例與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。見表1。

表1 不同濃度冬凌草甲素對HepG2 細(xì)胞周期的影響±s,%)

圖2 細(xì)胞周期流式圖

3 討 論

與其他一些常見的惡性腫瘤相比，肝癌的治療效果很差。外科手術(shù)仍然是最有可能為肝癌帶來治愈希望的治療手段。但是只有外科手術(shù)是不夠的，綜合治療必不可少，尋找肝癌治療的途徑勢在必行。我國對冬凌草及其有效成分的藥理研究始于20 世紀(jì)70 年代后期。此后，主要集中在對冬凌草甲素抗腫瘤作用及其機制的研究上。既往多項體外試驗表明,冬凌草甲素對多種人癌細(xì)胞株有生長抑制效應(yīng)〔7,8〕。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，細(xì)胞的增生、分裂、變形、凋亡和壞死等生理或病理過程都發(fā)生在它所處的細(xì)胞周期的某一時相；若細(xì)胞周期的某一時相出現(xiàn)異常，細(xì)胞將進(jìn)入與之相關(guān)的病理過程〔9〕。細(xì)胞周期受體內(nèi)外多種因子、多層次調(diào)控，而細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。幾乎所有的腫瘤都有一個共同的特征： 細(xì)胞周期調(diào)控機制破壞,導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長。G/M期DNA損傷檢驗點是細(xì)胞周期運行至有絲分裂前細(xì)胞自我修復(fù)的最后時機，本實驗研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素使細(xì)胞阻滯于G2/M 期,通過有絲分裂擾亂細(xì)胞進(jìn)程、抑制細(xì)胞生長。

細(xì)胞DNA在細(xì)胞周期運行過程中不斷受到外源性和內(nèi)源性因素的損傷。DNA損傷后激活細(xì)胞周期損傷檢驗點，啟動修復(fù)機制，在進(jìn)入有絲分裂之前修復(fù)損傷的DNA，確保轉(zhuǎn)錄基因組的完整性，如果修復(fù)失敗或者損傷因素積累，損傷的基因會隨著細(xì)胞分裂遺傳給子代細(xì)胞，就可能導(dǎo)致無法控制的細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致癌變〔10〕。細(xì)胞周期中主要的細(xì)胞DNA損傷檢驗點是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂前修復(fù)DNA損傷的最后時機〔11〕，共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴張突變基因(ATM)和Rad-3相關(guān)蛋白(ATM and Rad-3 related,ATR)激酶可以感知DNA損傷,并將DNA損傷信號傳導(dǎo)到下游靶蛋白,啟動應(yīng)激系統(tǒng),產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯，從而完成DNA修復(fù)或啟動細(xì)胞凋亡程序〔12～14〕，因此ATM和ATR對維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定和防止腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要。

本研究Western印跡結(jié)果表明，隨著冬凌草甲素濃度的增加，Phos-S1981ATM、anti-phosph-CHK2 (T68)、anti-phosph-CHK2 (T68)、Phos- p53和γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢。由以上結(jié)果可以分析，冬凌草甲素通過激活A(yù)TM蛋白細(xì)胞信號通路，引起G2/M期阻滯而為損傷DNA修復(fù)提供時間。細(xì)胞內(nèi)激活各種檢驗點相關(guān)蛋白,觸發(fā)檢驗點信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，激活由ATM R調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白作用下，感應(yīng)蛋白將DNA損傷信號傳遞至信號傳導(dǎo)蛋白，作用于相應(yīng)的效應(yīng)蛋白,通過“ATM-p53-CHK2”通路, 引起細(xì)胞周期G 期阻滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)，損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序激活。

本研究結(jié)果表明冬凌草甲素能夠通過激活A(yù)TM細(xì)胞信號通路、誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細(xì)胞發(fā)生阻滯，發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞生長的作用，從而調(diào)整細(xì)胞增殖與凋亡間的平衡。本試驗結(jié)果為研究冬凌草甲素抗腫瘤作用分子藥理機制是否與分子靶標(biāo)有關(guān)提供了一定的試驗依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1劉家云, 魏 敏, 顧琴龍. 冬凌草甲素抗腫瘤的研究進(jìn)展 〔J〕. 中國新藥與臨床雜志, 2010;29(2): 81-4.

2Chen JH, Wang SB, Chen DY,etal. The inhibitory effect of oridonin on the growth of fifteen human cancer cell lines〔J〕. Chin J Clin Oncol, 2007;4(1): 403-6.

3劉加軍, 李 橋, 潘祥林, 等. 冬凌草甲素對白血病NB4 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用及其機制 〔J〕. 中草藥, 2005;36(8): 1188-93.

4魏鳳香，李美玉，李紅枝，等.冬凌草甲素對肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2009;29(8):48-9.

5車憲平, 韓瑞發(fā), 周 晶, 等. 冬凌草甲素注射劑誘導(dǎo)膀胱癌 MB49 細(xì)胞凋亡及機制研究 〔J〕. 中草藥, 2008;29(8): 1219-22.

6張春玲, 吳立軍, 左海軍. 冬凌草甲素通過線粒體途徑誘導(dǎo)人黑色素瘤A375-S2 細(xì)胞凋亡 〔J〕. 中草藥, 2004;35(4 ): 423-6.

7Tian W, Chen SY. Recent advances in the molecular basis of anti-neoplastic mechanisms of oridonin〔J〕.Chin J Integr Med, 2013;19(4):315-20.

8Li D, Xu S, Cai H,etal.Enmein-type diterpenoid analogs from natural kaurene-type oridonin: Synthesis and their antitumor biological evaluation〔J〕.Eur J Med Chem,2013;64(12):215-21.

9Kikuchi K, Hettmer S, Aslam MI,etal. Cell-cycle dependent expression of a translocation-mediated fusion oncogene mediates checkpoint adaptation in rhabdomyosarcoma〔J〕. PLoS Genet,2014;10(1):e1004107.

10Kinner A,Wu W,Staudt C,etal. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin〔J〕.Nucleic Acids Res,2008;36(17): 5678-94.

11Stark GR，Taylor WR．Control of the GeM transition 〔J〕．Mol Biotechnol，2006;32(3)：227-48．

12Lee JH, PaullTT.ATM activation byDNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex〔J〕.Science, 2005;308(4): 551-4.

13Falck J,Coates J, Jackson SP.Conservedmodes of recruitment of ATM,ATR and DNA-PKcs to sites of DNA damage〔M〕.Nature,2005;434: 605-61.

14Jazayeri A, Falck J,Lukas C,etal.ATM-and cell cycledependent regulation of ATR in response to DNA double strand breaks〔J〕.Nat Cell Biol,2006:8(1):37-45.