顏志婷 熊建忠 林小小 黃樂松 (萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院藥劑科，江西 萍鄉(xiāng) 337055)

興奮性氨基酸的毒性作用在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用。谷氨酸是腦內(nèi)必需的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2是最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)腦內(nèi)90%以上的谷氨酸再攝取，調(diào)節(jié)突觸間隙的谷氨酸濃度，在多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中起重要作用。文獻(xiàn)表明〔1，2〕，多種β-內(nèi)酰胺類抗生素如頭孢曲松鈉等是興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2的轉(zhuǎn)錄激活劑，可以增加興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2的蛋白表達(dá)水平，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。本研究探討頭孢曲松鈉預(yù)處理對缺血性損傷腦保護(hù)的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 腫瘤壞死因子(TNF)-α的PCR引物(上海生物工程技術(shù)有限公司合成)。頭孢曲松鈉(臺灣泛生制藥廠股份有限公司提供，批號:1010050);2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色劑(TTC，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 雄性SD大鼠36只，體重250～300g，隨機(jī)分為3組:(1)假手術(shù)組(大鼠于手術(shù)前5 d開始注射頭孢曲松鈉，連續(xù)5 d，每天1次)。(2)生理鹽水(手術(shù)前5 d開始注射等量的生理鹽水，連續(xù)5 d)。(3)頭孢曲松鈉(手術(shù)前5 d開始注射頭孢曲松鈉，連續(xù)5 d)。

1.3 腦缺血再灌注模型的制作 以Longa改良法制備大鼠缺血再灌注模型。麻醉，頸部正中切口，在大鼠頸總動脈分叉處剪一小口，沿頸內(nèi)動脈向顱內(nèi)插入魚線(18.5±1.5)mm，栓塞90 min后將魚線拔出。假手術(shù)組魚線插入深度為10 cm，其余步驟同Longa改良法。

1.4 取材和HE染色 大鼠缺血再灌注24 h后，麻醉。生理鹽水和4%多聚甲醛PBS液進(jìn)行心臟灌注。斷頭取腦組織塊，固定，脫水，包埋，連續(xù)切片。常規(guī)HE染色。光鏡觀察，攝片。

1.5 TTC染色與腦缺血體積的測定 在缺血再灌注48 h后，每組取6只大鼠10%水合氯醛深度麻醉，快速斷頭取腦。將鼠腦立即置于-20℃冰箱中10 min后取出，行2 mm厚連續(xù)冠狀切片，共5片。將切片立即置于2%TTC溶液中，37℃恒溫下避光染色30 min，然后置于4℃ 4%多聚甲醛溶液中固定24 h。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色。分離蒼白區(qū) (梗死區(qū))和非蒼白區(qū)(正常區(qū))，梗死百分比(%)=蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量 +非蒼白區(qū)重量 )×100%〔3〕。

1.6 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 參照Bederson等確立的5級評分法對大鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分，分值越高，動物行為障礙越嚴(yán)重。0分:大鼠無神經(jīng)損傷癥狀。1分:大鼠不能完全伸展對側(cè)前爪。2分:大鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3分:大鼠向?qū)?cè)傾倒。4分:大鼠不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.7 TNF-α mRNA檢測 大鼠缺血再灌注48 h后斷頭取腦，取腦組織，迅速用液氮冷凍，并放置于-70℃保存。RNA提取采用異硫酸胍法。TNF-α上游引物:5＇CTCAAAACTCGAGTGACAAGC3＇，下游引物:5＇CCGTGATGTCTAAGTACTTGG3＇;GAPDH 上游引物 5＇AGTTCAACGGCACAGTCAAGG3＇，下游引物 5＇CTCAAAACTCGAGTGACAAGC3＇。逆轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增，參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。反應(yīng)條件:94℃ 2 min，然后按9℃ 1 min，50℃1 min，72℃ 1 min運(yùn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取出10 μl PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后照相，利用圖像分析系統(tǒng)對產(chǎn)物條帶進(jìn)行灰度掃描，TNF-α與內(nèi)對照GAPDH的灰度比值即為其mRNA表達(dá)半定量結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。多組間比較采用單因素方差分析。方差齊用Bonferroni法。方差不齊采用Welch法和Dunnett法。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)無神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能評分為0分。生理鹽水組大鼠有明顯神經(jīng)功能缺失，神經(jīng)功能評分增高。頭孢曲松鈉組大鼠神經(jīng)功能評分下降，與生理鹽水組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 TTC染色結(jié)果 假手術(shù)組TTTC染色均為紅色，腦組織無缺血灶。生理鹽水組相對腦缺血體積增加。頭孢曲松鈉組相對腦缺血體積下降，與生理鹽水組相比差異顯著。見表1。

2.3 TNF-α mRNA表達(dá) 假手術(shù)組腦組織中僅有少量TNF-α表達(dá)，生理鹽水組腦組織中TNF-α表達(dá)明顯增高，灰度值增加，頭孢曲松鈉組腦組織中TNF-α表達(dá)減少，灰度值下降，與生理鹽水組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1，圖1。

2.4 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯的變化，細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)均一。生理鹽水組可見皮質(zhì)神經(jīng)元灶性或片狀壞死，間質(zhì)及神經(jīng)元水腫明顯。頭孢曲松鈉組神經(jīng)元壞死減少，神經(jīng)元及間質(zhì)水腫明顯減輕。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分，TNF-α mRNA表達(dá)，相對腦缺血體積比較(s，n=12)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分，TNF-α mRNA表達(dá)，相對腦缺血體積比較(s，n=12)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 神經(jīng)功能評分(mm3)相對腦缺血體積(%)TNF-α 灰度值生理鹽水組 2.413 ±0.525 24.472 ±3.08 0.897±0.029假手術(shù)組 02) 02) 0.112±0.0072)頭孢曲松鈉組 1.325 ±0.2431) 16.156±2.6832) 0.421±0.0161)

圖1 TNF-α mRNA的表達(dá)

3 討論

缺血性腦血管病是威脅人類生命健康的主要疾病之一，薛敏等〔4〕研究認(rèn)為，年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、心房顫動及高高同型半胱氨酸血癥、抗血小板藥物依從性均為缺血性腦卒中患者復(fù)發(fā)的危險因素。文獻(xiàn)表明〔5〕，缺血性腦損傷時的腦組織可能產(chǎn)生大量的興奮性氨基酸，其中谷氨酸鹽的釋放占有重要作用。突觸內(nèi)谷氨酸濃度升高引起的一個效應(yīng)就是N-甲基-D-天冬氨酸受體的激活。N-甲基-D-天冬氨酸受體是鈣通透性的，能引起廣泛的膜去極化和鈣內(nèi)流，加劇細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。激活DNA酶、蛋白酶和磷脂酶等，并生成自由基，破壞生物膜，引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，在動物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用〔6〕。但是也有臨床研究認(rèn)為在急性缺血性腦卒中發(fā)病6 h內(nèi)靜脈使用N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑并無益處〔7〕，而且另一種谷氨酸受體拮抗劑加維斯替奈的相關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果亦顯示不佳〔8〕。這可能腦缺血后腦組織內(nèi)谷氨酸鹽迅速增高，而臨床治療卻在腦梗死后幾小時進(jìn)行，而此時腦組織內(nèi)谷氨酸鹽已達(dá)到高峰。

頭孢曲松鈉是第三代頭孢類抗生素。有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血前給予頭孢曲松鈉預(yù)處理對缺血性腦損傷有一定的腦保護(hù)作用。本研究證實(shí)，在大鼠腦缺血前給予頭孢曲松鈉預(yù)處理能起到緩解缺血后腦損傷的作用。頭孢曲松鈉對缺血后損傷的腦保護(hù)作用可能與降低腫瘤壞死因子TNF-α表達(dá)有關(guān)，它可能抑制膠質(zhì)產(chǎn)生谷氨酸載體，同時可能促進(jìn)谷氨酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)〔9〕。另外，頭孢曲松鈉預(yù)處理能增加腦缺血后谷氨酸載體的表達(dá)〔10〕，加速缺血后突觸內(nèi)谷氨酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少興奮性氨基酸的毒性作用。

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