易善永 南克俊 張麗娟 柯 洋 姜麗麗

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450007)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中含有極少量腫瘤干細胞(CSC)，它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等過程中起決定性作用〔1～4〕。本研究旨在探討肝癌MHCC97H細胞中CD133+和CD133-亞群分選及其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 MHCC97H細胞株購于上海中科院細胞庫；Balb/C裸鼠購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心。RPMI-1640 培養(yǎng)基(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。鼠抗人CD133抗體、兔抗人Bmi抗體、鼠抗人SMO抗體、兔抗人Notch-1抗體、鼠抗人β-catenin抗體、鼠抗人Oct3/4抗體(R&D公司)。鼠抗人PE-CD133、CD133免疫磁珠細胞分選系統(tǒng)(Miltenyi公司)，流式細胞儀(BD公司)。

1.2免疫磁珠法分選細胞 取呈對數(shù)生長期的人肝癌MHCC97H細胞株數(shù)瓶，胰酶消化，用0.4%臺盼蘭染色、計數(shù)，使細胞總量保持在1×108數(shù)量級。取上述準備好的MHCC97H細胞，按100 μl/108的比例加入FcR阻斷試劑；5 min后按100 μl/108的比例加入交聯(lián)CD133抗體的微磁珠標記MHCC97H細胞。充分混勻后在4～8℃冰箱內(nèi)孵育25 min。然后加入緩沖液進行離心，棄上清，制成細胞懸液；過MACS分離柱分選MHCC97H細胞，并分別收集CD133+和CD133-細胞。

1.3流式細胞儀檢測分選前后CD133的表達 分別取培養(yǎng)的對數(shù)生長期的MHCC97H細胞和分選后的CD133+細胞，并制備成單細胞懸液。分別加入PE-CD133抗體，并在暗處室溫下孵育30 min。并洗去未結(jié)合的抗體，上流式細胞儀檢測，采集圖像及數(shù)據(jù)分析。

1.5細胞體外增殖能力的比較 分別將上述各種細胞種植到96孔板中，每組細胞種10個孔，使每孔1×104個細胞，加入干細胞培養(yǎng)液放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、3、5、7天用MTT比色法測定各組細胞的增殖狀態(tài)。以各組平均OD490 nm值為縱坐標，培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.6Western印跡法檢測干細胞相關(guān)基因蛋白的表達 將準備好的細胞分別用胰酶進行消化處理，然后用PBS緩沖液洗滌兩次，離心棄上清液。加入細胞裂解液進行裂解，離心收集上清蛋白。行凝膠電泳，至酚溴藍染色接近膠底邊后停止電泳。電泳后將凝膠中的蛋白質(zhì)通過濕法電轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF，分別加入按適當比例稀釋的一抗(兔抗人Bmi單克隆抗體、鼠抗人SMO單克隆抗體、兔抗人Notch-1單克隆抗體、鼠抗人Oct3/4單克隆抗體或鼠抗人β-catenin單克隆抗體)；4℃過夜或37℃搖床2～3 h。去掉一抗，加入二抗。常規(guī)曝光、顯影、定影和分析。采用Image J圖像軟件對目的蛋白條帶的光密度值，以β-actin蛋白的光密度值進行標準校正，計算各目的蛋白與內(nèi)參照的相對吸光度值作為其表達的相對含量。

1.7裸鼠皮下接種成瘤實驗 取6只4～6周齡Balb/C裸鼠，并將其隨機分為3組。分別按梯度將1×103、1×104及1×105個CD133+和CD133-細胞接種于9只裸鼠前肢兩側(cè)背部皮下。4 w后用頸椎脫臼法處死裸鼠，切下皮下移植瘤，測量其大小，并計算其體積。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1MHCC97H分選前后CD133的表達 CD133在分選前的MHCC97H細胞株中呈低表達(1.09±0.43)%；CD133在分選后的CD133+細胞亞群中呈高表達(86.65±6.49)%。分選前后CD133的表達差異顯著(P<0.01)。

2.2免疫組化法檢測CD133在不同細胞中的表達 CD133在細胞胞膜和胞質(zhì)中表達，呈棕黃色均勻染色。在未分選的MHCC97H細胞株中胞膜及胞質(zhì)中偶見棕黃色顆粒，即CD133表達較弱；在分選后CD133+細胞亞群中胞膜及胞質(zhì)中可以看到大量的棕黃色顆粒，即CD133表達較強；在分選后CD133-細胞亞群及陰性對照組中胞膜及胞質(zhì)中未見棕黃色顆粒，即CD133不表達。經(jīng)過檢測，未分選MHCC97H細胞組的灰度值為186.37±21.23，分選后CD133+細胞組的灰度值為156.42±16.58，CD133在分選后表達升高(P<0.01)。見圖1。

未分選 分選后CD133+

2.3細胞體外增殖能力的比較結(jié)果 CD133+細胞的OD 490 nm值要高于CD133-細胞和未分選MHCC97H細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。從三組細胞的生長曲線圖可以看出，CD133+細胞組的曲線較陡直；未分選MHCC97H細胞組次之，生長曲線稍平緩；而CD133-細胞的生長曲線較為平坦。見表2。

表1 細胞體外增殖能力比較±s，n=30)

2.4不同細胞體內(nèi)成瘤實驗 將不同數(shù)量級的CD133+細胞與CD133-細胞分別各接種到3只裸鼠皮下。第3天時CD133+細胞組已有部分接種部位長出移植瘤，直到第4周CD133-細胞組才有1個接種部位有移植瘤形成。CD133+細胞組共有7個接種部位有移植瘤形成，而CD133-組只有1個接種部位有移植瘤形成。此外，CD133+細胞組形成的移植瘤體積、重量及數(shù)量均與CD133-細胞大。見表2。

2.5Western印跡法檢測結(jié)果 Bmi、SMO、Notch-1、Oct3/4和β-catenin蛋白在CD133+細胞中表達較強，而在CD133-細胞中則表達較弱(圖2)。分別將Bmi,SMO,Notch-1,Oct3/4和β-catenin蛋白條帶光密度與其相應(yīng)的β-actin的光密度進行比，然后再將其比值分別進行比較，CD133+細胞與CD133-細胞之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

圖2 Western印跡檢測不同細胞的干細胞相關(guān)基因蛋白表達

表2 CD133+和CD133-細胞成瘤的數(shù)量及大小

表3 不同細胞的干細胞相關(guān)基因蛋白表達±s,n=30)

3 討 論

近年來研究表明，腫瘤是由一小部分具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能的腫瘤干細胞驅(qū)動下發(fā)生的。它不僅是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵，而且還是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的源泉〔1～5〕。隨著對腫瘤認識觀念的改變，對腫瘤的治療也必須從一個新的視角去把握。轉(zhuǎn)變過去針對大部分增殖能力有限的腫瘤細胞進行治療的模式，針對腫瘤干細胞治療消滅腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根源，進而有可能治愈腫瘤〔6～8〕。

本研究中采用MACS技術(shù)對MHCC97H細胞株中CD133+細胞亞群進行分離，然后再用流式細胞儀檢測分離純度及分選效果〔2〕。本研究結(jié)果提示MACS是一個非常理想的分離純化肝癌干細胞樣細胞的方法。本實驗細胞免疫組化檢測結(jié)果顯示，與FACS定量分析結(jié)果基本吻合。在MHCC97H細胞株中只有(1.09±0.43)%的細胞恒定表達膜抗原CD133，這說明CD133+細胞只是人肝癌細胞株MHCC97H中含量非常少的一個亞群。

本實驗細胞生長曲線結(jié)果，提示CD133+細胞亞群具有較強的體外增殖能力，符合其作為腫瘤干細胞的生物學(xué)特性。

目前還不能從形態(tài)學(xué)上對腫瘤干細胞做出明確鑒定，只有從功能學(xué)方面對其進行鑒定〔2～4〕。雖然體外培養(yǎng)可一定程度上反映腫瘤干細胞的生物學(xué)特性，但最終還需要通過體內(nèi)成瘤實驗來進一步證實其致瘤性。體內(nèi)成瘤實驗是將分離純化的特定細胞亞群接種到裸鼠內(nèi)，通過觀察接種后是否可形成移植瘤、移植瘤體積大小以及移植瘤形成所需要的時間等來綜合判斷其致瘤能力〔7～9〕。本研究結(jié)果表明：CD133+細胞亞群的體內(nèi)成瘤能力遠遠大于CD133-細胞亞群，這也表明CD133+細胞具有腫瘤干細胞的生物學(xué)特性。隨后將移植瘤切除，制成病理切片，進行常規(guī)HE染色。病理觀察可見，移植瘤與人原發(fā)肝癌在病理形態(tài)上非常相似。這些結(jié)果表明CD133+細胞亞群在裸鼠體內(nèi)增殖分化產(chǎn)生了移植瘤內(nèi)其他細胞，也證實了它具有較強的增殖分化潛能。因此，本研究認為CD133是人肝癌細胞株MHCC97H的腫瘤干細胞標志之一。

近年來研究表明，腫瘤干細胞和正常干細胞具有很多相似的生物學(xué)特性，這可能與它們具有某些相同的干細胞自我更新、增殖和分化調(diào)控基因有關(guān)〔7〕。本研究Western印跡檢測結(jié)果提示CD133+細胞亞群高表達這些與干細胞/前體細胞增殖、自我更新以及決定其特性密切相關(guān)的基因，進而證實CD133+細胞具有干細胞特性。

綜上所述，本研究證實肝癌MHCC97H細胞中存在CD133+細胞亞群，其增殖、多向分和成瘤性均高于CD133-細胞亞群，并且高表達干細胞相關(guān)基因，如：Bmi,Hedgehog/SMO,Notch-1,Oct3/4,Wnt/β-catenin等。因此，本研究認為CD133+細胞可能富集了腫瘤干細胞，從而為肝癌今后的治療提供一種新方法和新思路。

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