張雪梅 楊 芳 邢國慶

(泰山醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)實驗室，山東 泰安 271000)

針灸能改善帕金森病(PD)患者的癥狀，提高其生活質(zhì)量〔1〕；但由于臨床針灸研究工作的局限性，無法進(jìn)行系統(tǒng)、準(zhǔn)確的觀察和分析，影響了對針灸治療PD的療效評價，同時也缺乏對針灸治療PD機(jī)制的深入研究。在針灸治療PD動物模型的研究報道中已經(jīng)揭示〔2～4〕，高頻電針刺激能有效改善PD模型動物的異常行為，并能保護(hù)多巴胺(DA)能神經(jīng)元，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子等的作用。PD運(yùn)動癥狀的產(chǎn)生與基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路關(guān)系密切，因此調(diào)整基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的功能可能是揭示針灸改善PD運(yùn)動癥狀的機(jī)制所在。本實驗擬在線刀切斷內(nèi)側(cè)前腦束(MFB)的模型大鼠上，通過檢測電針對紋狀體內(nèi)的酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學(xué)的變化來證實電針的治療作用，分別在蒼白球和腹側(cè)中腦部位檢測谷氨酸脫羧酶(GAD)67蛋白水平的改變，來探究電針是否通過對基底節(jié)輸出核團(tuán)γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元活性的調(diào)控而發(fā)揮治療效應(yīng)，以深入了解電針治療的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 實驗用Wistar雄性大鼠24只，體重200～250 g，由山東省中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供〔合格證號:SCXK(魯)20050015-0001684〕。每籠4只群養(yǎng)，12 h/12 h晝夜循環(huán)照明，自由飲水和進(jìn)食。主要藥品和儀器如下：阿撲嗎啡(APO,Sigma公司)，小鼠單克隆抗TH抗體(Sigma公司)，GAD67抗體：小鼠抗GAD67單克隆抗體(CHEMICON公司)；大鼠腦立體定位儀、可伸縮線刀(美國KOPF公司)，大鼠旋轉(zhuǎn)行為記錄儀(美國Columbus Instruments)。

1.2模型制備與處理 機(jī)械損傷MFB建立單側(cè)PD模型〔5〕。動物用水合氯醛(350 mg/kg，i.p.)麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上。Scoutern 線刀在立體定位儀的引導(dǎo)下，切斷MFB，定位坐標(biāo)為：前囟后3.5 mm，矢狀線右側(cè)旁開2.5 mm，硬膜下7.5 mm，得到單側(cè)損傷的PD大鼠模型。動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針治療組，每組大鼠數(shù)量在8只以上。術(shù)后第2天開始電針治療，選取百會和大椎穴位，用HANS電針儀，施加逐級增強(qiáng)的電流強(qiáng)度，1、2和3 mA各持續(xù)10 min，共計30 min，1次/d，連續(xù)6 d為1個療程，第7天進(jìn)行行為學(xué)檢測，共治療4個療程。

1.3檢測指標(biāo) 異常旋轉(zhuǎn)行為的檢測是將大鼠穿上束縛套后置于測試儀中，皮下注射APO(0.5 mg/kg)后記錄大鼠誘發(fā)出現(xiàn)的旋轉(zhuǎn)行為，計算大鼠在單位時間內(nèi)的凈旋轉(zhuǎn)次數(shù)。黑質(zhì)網(wǎng)狀部的神經(jīng)元主要是支配丘腦的GABA能投射神經(jīng)元，檢測中腦部位的GAD67的表達(dá)，能反映中腦部位尤其是黑質(zhì)網(wǎng)狀部GABA能神經(jīng)元的活性。對各組大鼠在電針治療28 d后，取腹側(cè)中腦部位組織，用Western印跡檢測中腦GAD67表達(dá)的變化。Western印跡檢測中腦GAD67含量，一抗為鼠抗GAD67抗體(1∶500)，并加入用于作為內(nèi)參的小鼠抗β-actin抗體，4℃孵育過夜。羊抗小鼠二抗(1∶3 000)孵育2 h后PBS洗去膜，成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜。組化染色方法檢測TH及GAD67形態(tài)改變，對大鼠灌流固定取全腦，冰凍切片厚度30 μm，分別進(jìn)行染色后拍照。

2 結(jié) 果

2.1電針對PD模型大鼠異常旋轉(zhuǎn)行為的影響 模型組大鼠在術(shù)后第1周起就能產(chǎn)生由(APO)誘發(fā)的向未損傷側(cè)(左側(cè))的異常旋轉(zhuǎn)行為，并呈進(jìn)行性加重趨勢；在第4周起，模型組大鼠的異常旋轉(zhuǎn)行為與假手術(shù)組相比明顯增多，而電針治療可以明顯降低PD大鼠的異常旋轉(zhuǎn)行為。

2.2電針對PD模型大鼠紋狀體內(nèi)TH免疫反應(yīng)陽性纖維的影響 PD大鼠在損傷側(cè)紋狀體內(nèi)TH陽性纖維丟失比較明顯，其損傷側(cè)/未損傷側(cè)的TH陽性纖維比值只有假手術(shù)組的34.7%(P<0.01)，電針治療組的TH陽性纖維的光密度值明顯增加，相對于模型組的纖維光密度值增加了45%(P<0.01)，表明電針治療能減緩MFB損傷側(cè)的TH陽性纖維的丟失，具有一定的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。見圖1。

2.3電針對GAD67蛋白在腹側(cè)中腦表達(dá)的影響 MFB損傷側(cè)中腦部位的GAD67表達(dá)含量顯著增加，與假手術(shù)組相比較顯著增加(P<0.01)。電針治療能降低中腦部位的GAD67的過表達(dá)，與模型組相比較有顯著增加(P<0.05)，提示電針治療能降低中腦部位的GAD67的表達(dá)增多，電針降低了黑質(zhì)網(wǎng)狀部的GABA能神經(jīng)元的活性。見圖2。

圖1 各組大鼠紋狀體內(nèi)TH免疫組化表達(dá)(DAB,×40)

圖2 Western印跡檢測中腦GAD67表達(dá)

2.4電針對蒼白球內(nèi)GAD67陽性神經(jīng)纖維分布的影響 模型組損傷側(cè)蒼白球內(nèi)的GAD67陽性纖維染色出現(xiàn)增強(qiáng)，電針治療對這種增強(qiáng)沒有明顯影響；定量分析，模型組比假手術(shù)組的光密度值高出38%(P<0.05)；而電針治療組與模型組的光密度值相比沒有明顯區(qū)別(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠腦蒼白球內(nèi)GAD67免疫組化表達(dá)(DAB，×40)

3 討 論

PD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)退行性疾病，其病理變化主要是中腦黑質(zhì)致密部(SNc)DA能神經(jīng)元出現(xiàn)漸進(jìn)性丟失，導(dǎo)致靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動遲緩等為特征的臨床癥狀。

有研究表明〔3〕，電針治療能明顯緩解機(jī)械損傷MFB的PD模型中黑質(zhì)部位DA能神經(jīng)元的變性，可能是電針通過增加腦內(nèi)營養(yǎng)因子的表達(dá)，而對DA神經(jīng)元產(chǎn)生營養(yǎng)而具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示，電針也能夠緩解PD的異常旋轉(zhuǎn)行為，同時對來自于黑質(zhì)部位的DA能神經(jīng)元投射到紋狀體內(nèi)的TH陽性神經(jīng)纖維也具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果與以前的研究類似，均證實了電針的治療效應(yīng)。

基底神經(jīng)節(jié)屬于皮層下的結(jié)構(gòu)，與運(yùn)動功能、學(xué)習(xí)和記憶等功能都有關(guān)聯(lián)〔6〕。在基底節(jié)中，紋狀體接受來自皮層和丘腦的谷氨酸能(GLU)的傳入，再通過兩條通路發(fā)出GABA能投射到基底節(jié)的主要輸出核團(tuán)(SNr)和蒼白球內(nèi)側(cè)核(GPi)，輸出核團(tuán)再調(diào)節(jié)丘腦的活性實現(xiàn)對運(yùn)動的調(diào)控?；谶@樣的結(jié)構(gòu)組成，SNr神經(jīng)元的活性應(yīng)該主要是受到GABA 和GLU 相互平衡的調(diào)節(jié)控制。然而，Windels等〔7〕用電生理和微電泳的實驗證實，調(diào)節(jié)SNr神經(jīng)元活性的主要因素是GABA能的傳入，而不是GLU和GABA相互對抗作用的結(jié)果。這一假說進(jìn)一步被實驗驗證，即向SNr內(nèi)移植可釋放GABA的工程細(xì)胞，顯著減少PD大鼠模型的下頜震顫，其改善癥狀的原因就是GABA通過對SNr的神經(jīng)元活性進(jìn)行調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用〔8〕。SNr神經(jīng)元接受來自紋狀體、蒼白球及SNr內(nèi)相鄰細(xì)胞軸突的GABA能傳入，這些GABA傳入的作用就是抑制了SNr神經(jīng)元的活性。以上均提示本實驗需要進(jìn)一步關(guān)注GABA等神經(jīng)遞質(zhì)對PD運(yùn)動癥狀的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其對DA能神經(jīng)元的影響。

在PD狀態(tài)下，由于紋狀體DA的減少，經(jīng)過基底節(jié)環(huán)路傳導(dǎo)的結(jié)果之一就是基底節(jié)輸出核團(tuán)的神經(jīng)元過度活躍〔9〕。因此，藥物、手術(shù)損毀或電刺激等對PD患者的治療，可能都是通過影響SNr或GP神經(jīng)元的活性來發(fā)揮療效的。本實驗結(jié)果揭示出電針能抑制基底節(jié)輸出核團(tuán)SNr神經(jīng)元在損傷時的過度活躍，從而增加丘腦的興奮性，得以改善PD癥狀。

有實驗也證實〔10〕，在PD動物模型中蒼白球GABA的釋放增加，或蒼白球投射到SNr和EP的神經(jīng)元表達(dá)的GAD67 mRNA也都有增加，及蒼白球神經(jīng)元的放電增加。這些結(jié)果提示蒼白球的功能比較復(fù)雜，并不單純是由紋狀體蒼白球通路的過渡活躍所致蒼白球神經(jīng)元的活性降低。此外，蒼白球也受到底丘腦核的GLU興奮性投射增加其活性，以及紋狀體蒼白球通路末梢的ENK也可以產(chǎn)生突觸前抑制作用，減少了紋狀體蒼白球通路末梢GABA的釋放〔11〕。本實驗未能檢測到電針對蒼白球內(nèi)GAD67染色的改變，可能是多種因素的相互干預(yù)。

本實驗結(jié)果初步提示電針可產(chǎn)生行為改善效應(yīng)，并且這種作用可能是通過抑制了基底節(jié)輸出核團(tuán)神經(jīng)元的活性而實現(xiàn)的，而進(jìn)一步的工作尚需充分驗證。

4 參考文獻(xiàn)

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