王 亮 吳友平 鄭振中 殷 然 王夢(mèng)洪 鄭澤琪 彭景添 魏云鋒

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西 南昌 330006)

人纖維介素(fgl2)屬于纖維蛋白家族中的一員，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，可分為胞質(zhì)、跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域3部分。fgl2由活化的巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)fgl2的研究主要集中在肝病方面的研究，提示其可能參與血管新生等病理生理過程，但目前缺乏關(guān)于fgl2對(duì)MMVECs增殖、遷移等血管形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)的直接證據(jù)〔1～3〕。本研究通過制作并包裝fgl2的RNA干擾慢病毒，轉(zhuǎn)染心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MMVECs)，觀察fgl2沉默對(duì)MMVECs增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及輔助包裝原件載體質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄RNA試劑盒購(gòu)自Promega公司；RNase-free購(gòu)自Axygen公司；小鼠抗人Flag抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，山羊抗小鼠IgG 抗體、小鼠抗人GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2shRNA慢病毒重組載體構(gòu)建及病毒包裝 從GenBank中查找大鼠fgl2基因，按RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)4組針對(duì)fgl2基因cds區(qū)的靶序列，同時(shí)按公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)合成無(wú)意義序列作陰性對(duì)照(PSCNC)。每組序列均按發(fā)卡結(jié)構(gòu)模式設(shè)計(jì)合成，在其兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)黏端，直接聯(lián)入酶切后的載體。DNA片段均由上海吉?jiǎng)P基因公司合成。設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸片段稀釋后在退火反應(yīng)體系中形成雙鏈DNA片段，經(jīng)T4 DNA連接酶插入到經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的線性質(zhì)粒pGCSIL-GFP中。回收載體片段，與雙鏈DNA片段行連接反應(yīng),轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，搖菌后接種到LB瓊脂培養(yǎng)基，篩選陽(yáng)性克隆行PCR及測(cè)序鑒定。每組產(chǎn)物中隨機(jī)選5個(gè)菌落克隆溶于10 μl LB中，取1 μl為PCR模板；陰性對(duì)照為dd H2O；陽(yáng)性對(duì)照為含針對(duì)GAPDH siRNA插入片段的載體質(zhì)粒。fgl2上游：5′- CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA -3′；下游:5′- GTAATACGGTTATCCACGCG -3′。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min，4℃保存。

Western印跡檢測(cè)外源篩選有效靶點(diǎn)的干擾效果，確認(rèn)有效靶點(diǎn)并進(jìn)行病毒包裝。將含慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒的DNA溶液(pGC-LV載體20 μg，pHelper1.0載體15 μg，pHelper2.0載體10μg)，與Opti-MEM等體積混勻，調(diào)總體積為2.5 ml,與脂質(zhì)體2000混勻，室溫孵育20 min,轉(zhuǎn)到含293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞上清液，4℃，4 000 r/min離心10 min，過濾上清，離心，棄上清，加PBS 50～100 μl，-80℃保存。96孔板接種293T細(xì)胞，調(diào)至每孔4×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。根據(jù)待測(cè)滴度，每個(gè)Ep管加90 μl無(wú)血清培養(yǎng)基。取待測(cè)病毒原液10 μl至第1管中混勻，繼續(xù)相同的操作至最后1管。選所需的孔棄培養(yǎng)基，加等量稀釋的病毒液，培養(yǎng)4 d后觀察熒光表達(dá)情況，將最后兩個(gè)含熒光細(xì)胞的孔中熒光細(xì)胞的個(gè)數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即病毒原液的滴度值。系列稀釋法測(cè)定病毒滴度為1×109TU/ml。

1.3MMVECs培養(yǎng)與鑒定 取7 d大鼠乳鼠心臟剪去主動(dòng)脈、左右心房、右心室，保留左心室，用PBS洗凈血液。小心剝離心外膜及心內(nèi)膜。用75%乙醇滅活30 s，用PBS沖洗干凈，剪碎，加入適量的0.08%胰蛋白酶，37℃水浴消化3次。適量0.1% Ⅱ型膠原酶(用不含血清DMEM稀釋)消化組織，置于孵箱中消化3 h。轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中，加含血清的培養(yǎng)基終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸沉淀。反復(fù)離心3次。離心所得的細(xì)胞用200目篩網(wǎng)過濾，過濾后所得細(xì)胞懸于20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，接種于0.2%明膠預(yù)處理的培養(yǎng)瓶中37℃培養(yǎng)。每隔2 d換液1次，直至長(zhǎng)成細(xì)胞單層，0.125%胰蛋白酶消化傳代，選第3代傳代內(nèi)皮細(xì)胞。0.125%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，傳代至爬片上，孵箱過夜，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，取出爬片，固定后采用免疫熒光方法檢測(cè)MMVECs特異性標(biāo)志CD31-RA、Ⅷ-RA。

單純MMVECs組(對(duì)照組)、攜帶GFP空載質(zhì)慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs(GFP組)、Fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs(fgl2-RNAi-LV組)。培養(yǎng)96 h后分別收集MMVECs。取第3代MMVECs用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 d將MMVECs以適當(dāng)密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。24 h待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，慢病毒轉(zhuǎn)染6～8 h后，更換20%胎牛血清培養(yǎng)基。24～72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)。

1.4細(xì)胞總RNA提取及鑒定 轉(zhuǎn)染96 h后，去除6孔板中的培養(yǎng)基，按1.0 ml/1.0×106細(xì)胞加入的Trizol試劑，輕輕晃動(dòng)，使其充分裂解。移入1.5 ml去RNA酶的EP管中，室溫(15℃～30℃)靜置5 min。嚴(yán)格按照Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行，加入0.2 ml氯仿，蓋緊蓋子劇烈震蕩EP管15 s，室溫靜置3 min。4℃，8 000 r/min，離心15 min，可見混合物分層。將上層水相約350 μl轉(zhuǎn)移入另一新的去RNA酶EP管中，加入0.5 ml異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。4℃，8 000 r/min，離心10 min，管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入75%乙醇1.0 ml，混勻后，4℃，5 000 r/min，離心5 min。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀，加入20 ml DEPC水溶解。樣本RNA取少許稀釋100倍后，以核酸蛋白分析儀測(cè)定OD260、OD280及OD260/OD280值，計(jì)算RNA的純度和濃度，-70℃保存以備用。

1.5qRT-PCR測(cè)定各組MMVECs中fgl2 mRNA的表達(dá) 引物的設(shè)計(jì)根據(jù) GenBank 庫(kù)中相應(yīng) cDNA 序列進(jìn)行。每個(gè)樣品重復(fù)3次，用ABI7500檢測(cè)分析。以作β-actin內(nèi)參，用2-△△Ct計(jì)算結(jié)果。引物序列及反應(yīng)條件見表1。

表1 引物序列及反應(yīng)條件

1.6MTT檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力 用含10%胎牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔104個(gè)細(xì)接種細(xì)胞接種到 96 孔板,每孔體積 200 μl(每組設(shè)8個(gè)孔，2個(gè)對(duì)照孔)按照一般內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)條件，培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)4 d后,每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml用 PBS 配制,pH=7.4)10 μl，繼續(xù)孵育 4 h,呈色，終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加 100 μl DMSO,振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解，選擇 490 nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,以時(shí)間為比色橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 μl預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15～30 min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×105，取細(xì)胞懸液200 μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500 μl含20%FBS的培養(yǎng)基。將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h。細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)：用棉簽上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下，取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR檢測(cè)fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs后fgl2的表達(dá)變化 與對(duì)照組(為參照)與GFP組比較，fgl2-RNAi-LV組的fgl2表達(dá)明顯下調(diào)(0.198±0.02，P<0.05)，而對(duì)照組與GFP組(0.984±0.08)無(wú)明顯差異，提示慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs后fgl2的表達(dá)明顯下降。

2.2Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 與對(duì)照組(7.8±1.24)與GFP組(7.4±1.56)比較，fgl2-RNAi-LV組的遷移能力增強(qiáng)(16.2±2.44,P<0.05)，而對(duì)照組與GFP組無(wú)明顯差異(P>0.05)。見圖1。

2.3MTT檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力 與對(duì)照組與FGP組比較，fgl2-RNAi-LV組的MMVECs的增殖能力與遷移能力增強(qiáng)(P<0.05)，而對(duì)照組與GFP組無(wú)明顯差異(P>0.05)。見圖2。

圖1 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力(×400)

圖2 MTT檢測(cè)MMVECs增殖

3 討 論

慢病毒載體是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型載體,其感染效率高、細(xì)胞免疫反應(yīng)小,而且能通過基因整合穩(wěn)定持續(xù)地產(chǎn)生小干擾RNA(siRNA)而發(fā)揮沉默效應(yīng)〔4〕。RNAi是一種能夠高效、特異地下調(diào)目標(biāo)基因表達(dá),并在基因功能學(xué)研究和基因治療領(lǐng)域有著廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)〔5～7〕。本研究合成的pGCSIL-fgl2shRNA 慢病毒表達(dá)載體具有高效的感染效率、確切的干涉效果及持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)優(yōu)勢(shì)，將fgl2-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs,收集細(xì)胞,經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，fgl2明顯下調(diào),說(shuō)明fgl2-shRNA載體構(gòu)建成功。

在血管生成過程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移是血管發(fā)生的最基本和最重要的環(huán)節(jié)〔8〕。MMVECs是缺血心肌血管新生的重要因素。大血管內(nèi)皮與微血管內(nèi)皮細(xì)胞在生物活性〔9〕，對(duì)各種物質(zhì)反應(yīng)性等方面均存在著明顯的不同〔10〕，并且微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的組織器官異質(zhì)性〔11〕，即與細(xì)胞所來(lái)源的器官功能密切相關(guān)。利用大血管內(nèi)皮細(xì)胞研究的結(jié)果很難客觀、準(zhǔn)確地解釋微血管內(nèi)皮細(xì)胞。所以要準(zhǔn)確地反映所研究的組織

或器官的功能機(jī)制，最好選擇組織或器官的微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象〔12〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)fgl2基因沉默能夠促進(jìn)MMVECs的增殖和遷移，提示fgl2參與微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的調(diào)控，但是其機(jī)制并不清楚。

總之，本研究明確了fgl2參與調(diào)控心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移等血管新生關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步研究fgl2在血管新生調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

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