高婷婷

(寧波市中心醫(yī)院，浙江 寧波 315000)

宮頸癌常見鱗狀細胞癌，是臨床多發(fā)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其對于老年患者，其復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移成為導(dǎo)致患者死亡的重要因素之一。腫瘤轉(zhuǎn)移是癌細胞與宿主細胞相互作用的連續(xù)復(fù)雜過程。這個復(fù)雜的過程是由一系列基因調(diào)控系統(tǒng)組成。研究〔1〕表明，星形細胞上調(diào)基因(AEG)-1與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在唾液腺癌、原發(fā)性膽囊癌、卵巢癌和乳腺癌等組織中發(fā)現(xiàn)AEG-1的表達異常升高；AEG-1在宮頸癌組織中的表達也顯著高于正常組織〔2〕，提示AEG-1可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其分子機制尚需探討。本研究對siRNA介導(dǎo)的AEG-1表達沉默的人宮頸鱗癌細胞SiHa的周期性變化進行研究，并對其發(fā)生的分子機制進行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 人正常宮頸組織以及宮頸癌組織均來自于我院近年來收治的宮頸癌患者以及健康體檢人群，實驗組織均經(jīng)過病理學(xué)檢查確認。SiHa細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)液和胰蛋白酶均購自GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，AEG-1-siRNA、siRNA和兔多克隆抗體AEG-1均為美國Zymed公司產(chǎn)品，鼠單克隆抗體cdk2以及兔多克隆抗體eyelin D1均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染 SiHa細胞復(fù)蘇后，置含5%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基中。達到85%～95%細胞融合度時，按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明，以siRNA和AEG-1-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細胞。轉(zhuǎn)染后將細胞分為三組：未轉(zhuǎn)染組(不作任何處理)、siRNA對照組和AEG-1-siRNA轉(zhuǎn)染組。

1.2.2Western印跡測定蛋白表達 裂解細胞(細胞數(shù)1×107加100 μl lysis buffer)，根據(jù)樣品蛋白濃度，按蛋白總量50 μg計算體積。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)垂直電泳200 V 90 min，100 V濕法轉(zhuǎn)膜。分別結(jié)合I抗〔AEG-1抗體，細胞周期蛋白(cyclin D1)、CDK2、β-actin抗體〕，4℃過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBS/T)清洗5 min×3遍后，結(jié)合Ⅱ抗(HRP-la-beled羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG抗體)，室溫1 h，溫和振蕩。TBS/T振蕩清洗5 min×3遍。至暗房，加電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色液作用1 min，感光、洗片。將所得照片掃描，輸入計算機，用Quantity one軟件掃描得吸光度值，以AEG-1、細胞周期蛋白cyclin D1、CDK2與β-actin平均吸光度比值做定量分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.3流式細胞儀檢測SiHa細胞周期 收集轉(zhuǎn)染后48 h的SiHa細胞(每組約1×106個)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，置4℃ 70%冰乙醇固定30 min。冷PBS漂洗3次，然后重懸細胞于含40 μg碘化丙啶和100 μg RNaseA的PBS溶液中，于37℃孵育30 min。采用流式細胞儀檢測樣品DNA含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較使用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1正常組織、細胞與宮頸癌組織、細胞中AEG-1的表達 正常宮頸組織的AEG-1蛋白表達量(0.03±0.01)顯著低于宮頸鱗癌組織中的蛋白表達量(0.41±0.07)(P<0.05)；SiHa細胞中的AEG-1蛋白表達量顯著高于對照細胞中AEG-1蛋白表達量(0.13±0.16)(P<0.05)。

AEG-1-siRNA對SiHa細胞中AEG-1表達有顯著地下調(diào)作用(P<0.05)，AEG-1-siRNA轉(zhuǎn)染組SiHa細胞中AEG-1表達量(0.16±0.07)顯著低于未轉(zhuǎn)染組(0.79±0.11)以及對照siRNA轉(zhuǎn)染組(0.81±0.12)(P<0.05)。

2.2AEG-1表達的下調(diào)可以顯著增加SiHa細胞在G0/G1期的數(shù)量(P<0.05)。AEG-1-siRNA組SiHa細胞在G0/G1期的比例顯著高于未轉(zhuǎn)染組以及siRNA對照組(P<0.05)。AEG-1-siRNA組SiHa細胞在S期的比例顯著低于未轉(zhuǎn)染組以及siRNA對照組(P<0.05),且AEG-1-siRNA組細胞中cyclin D1以及CDK2等蛋白的表達顯著低于對照siRNA組(P<0.05)。見表1。

表1 AEG-1表達對細胞周期的影響

3 討 論

近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，如何從分子水平闡明宮頸鱗癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機制，尋求理想的分子指標進行預(yù)后評估，是降低宮頸鱗癌患者病死率的有效途徑之一。AEG-1是近年發(fā)現(xiàn)的新的基因。隨著對AEG-1的深入研究，發(fā)現(xiàn)AEG-I不僅促進神經(jīng)退行性變的發(fā)生，還促進腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵基因〔3〕。AEG-1參與了多種調(diào)控細胞增殖、凋產(chǎn)和轉(zhuǎn)移的信號通路的激活。

研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，AEG-1可以激活腫瘤細胞增殖途徑并且減少腫瘤細胞凋亡，因此可以促進其增殖。在乳腺惡性腫瘤和前列腺惡性腫瘤的相關(guān)臨床研究中發(fā)現(xiàn)，細胞周期抑制因子表達的下調(diào)有可能與AEG-1表達的上調(diào)有因果關(guān)系，這些變化可以促進細胞增殖。此外，有研究表明〔5〕，在神經(jīng)母細胞腫瘤中，抑制AEG-1表達可以引起細胞周期停滯在G0/G1期，抑制細胞分裂增殖。為深入研究AEG-1在宮頸惡性腫瘤中發(fā)揮的作用，以AEG-1表達量最多的SiHa細胞為研究對象，使用AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細胞，研究顯示AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，AEG-1蛋白表達量出現(xiàn)明顯降低，這一結(jié)果為深入研究AEG-1在宮頸惡性腫瘤中發(fā)揮的作用提供了良好的基礎(chǔ)。現(xiàn)利用流式細胞術(shù)進行進一步研究分析，觀察轉(zhuǎn)染前后SiHa細胞周期分布的變化，結(jié)果顯示AEG-1 siRNA組中停滯在G0/G1期的SiHa細胞比率大大高于對照siRNA組和未作任何處理組，而且S期細胞的比率也比對照siRNA組和未作任何處理組于要高，這一結(jié)果顯示AEG-1表達下調(diào)可以誘導(dǎo)細胞周期停滯在G0/G1期，進而可以降低宮頸惡性腫瘤細胞的增殖。深入研究分析表明〔6〕，AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染后，與細胞分裂增殖關(guān)系較密切的cdk2和cyclin D1蛋白的表達也出現(xiàn)明顯降低，這表明AEG-1誘導(dǎo)出現(xiàn)的宮頸惡性腫瘤細胞周期靜止現(xiàn)象可能與cdk2和cyclin D1蛋白表達降低有密切的關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，AEG-1在宮頸鱗癌組織以及細胞中有較高的表達，該蛋白的高表達顯著影響了SiHa的周期，使其在G0/G1期比例顯著增加，該現(xiàn)象的分子機制可能與cyclin D1以及CDK2的表達下調(diào)有相關(guān)性。

4 參考文獻

1梁紫影，張兆祥.星形膠質(zhì)細胞上調(diào)基因-1(AEG-1)與腫瘤〔J〕.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2011;27(3):297-300.

2Li J，Zhang N，Song LB,etal．Astrocyte elevated gene-1 is a novel prognostic marker for breast cancer progression and overall patient survival〔J〕．Clin Cancer Res，2008;14(21)：3319-26.

3Emdad L, Lee SG, Su ZZ,etal. Astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) functions as an oncogene and regulates angiogenesis〔J〕. Proc Nat Acad Sci, 2009;106(50): 21300-5.

4Brown DM, Ruoslahti E. Metadherin, a cell surface protein in breast tumors that mediates lung metastasis〔J〕. Cancer Cell, 2004; 5(4): 365-74.

5Li J, Yang L, Song L,etal. Astrocyte elevated gene-1 is a proliferation promoter in breast cancer via suppressing transcriptional factor FOXO1〔J〕. Oncogene, 2009; 28(36): 3188-96.

6崔曉峰，劉愛軍，韋立新，等．細胞周期蛋白Gl在喉鱗狀細胞癌中的表達及其臨床病理學(xué)意義〔J〕．中華病理學(xué)雜志，2008;37(3)：165-8.