劉 平 陳志宏 劉金霞

(承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000)

腎癌(RCC)是泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤，起源于腎小管上皮，近20年來發(fā)病率不斷上升，其中腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是腎癌的常見發(fā)病類型〔1,2〕。RCC發(fā)生的確切病因與發(fā)病機制仍不清楚，且其生物學(xué)行為極其復(fù)雜，推斷其病因可能是在遺傳背景易感性的內(nèi)在基礎(chǔ)上，生物、化學(xué)和物理等外在環(huán)境因素的持續(xù)影響，促進(jìn)了RCC的發(fā)生和發(fā)展。CA9是目前癌癥生物學(xué)界的熱門研究基因，該基因是位于P13K/AKT/MTOR通路的下游序列，并與VHL基因的表達(dá)產(chǎn)物pVHL和HIF-α存在著密切關(guān)系〔3〕。近年的研究發(fā)現(xiàn)，CA9對于明確RCC診斷、反應(yīng)治療情況及判斷預(yù)后具有重要價值。本研究以慢病毒轉(zhuǎn)染抑制人CA9基因在ccRCC 786-O細(xì)胞的表達(dá)，利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法觀察腫瘤細(xì)胞生長活性的變化，并應(yīng)用Western印跡方法檢測CA9蛋白和Survivin蛋白的表達(dá)變化情況，初步探討CA9影響RCC生長的可能信號途徑。

1 材料與方法

1.1材料 ccRCC 786-O由北京大學(xué)泌尿外科研究所提供，5% CO237℃下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞分為786-O組和786-O轉(zhuǎn)染組進(jìn)行實驗。

1.2主要試劑 CA9 siRNA重組慢病毒(CA9-RNAi-lentivirus)由上海吉凱基因公司提供，CA9 siRNA靶序列：5′-AGTTAAGCCTAAATCAGAA-3′。兔抗人CA9多克隆抗體、兔抗人Survivin單克隆抗體，購自美國CST公司；兔抗人β-actin抗體、堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將5～6萬個培養(yǎng)的786-O細(xì)胞去血清培養(yǎng)8 h使細(xì)胞同步化，將慢病毒液體以1∶10 000細(xì)胞數(shù)的比例加入到培養(yǎng)皿中，8 h更換含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.4MTT法及流式細(xì)胞學(xué)檢測 利用MTT和流式試劑盒檢測72 h轉(zhuǎn)染成功的786-O細(xì)胞的活力和凋亡情況。786-O細(xì)胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成懸液，接種于96孔板，培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)染慢病毒為對照組。轉(zhuǎn)染12、24、48、72、96 h檢測，待檢孔加含MTT的單溶液試劑20 μl，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀在490 nm波長處測吸光度A值，繪制細(xì)胞生長曲線，通過A值計算抑制率(IR)，IR=(1-轉(zhuǎn)染組A值/對照組A值)100%。用不應(yīng)用含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化液消化待測細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次細(xì)胞， 500 μl Binding Buffer加入懸浮細(xì)胞中，5 μl Annexin V-FITC加入懸液混勻，加入5 μl Propidium Iodide，細(xì)胞懸液混勻，于室溫、避光環(huán)境中反應(yīng)5～15 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5Western印跡法檢測 提取786-O細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞各40 μg蛋白，加入含β-巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水中水浴5 min，利用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離電泳，電泳后蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，PBS清洗3次，加入兔抗人CA9多克隆抗體、兔抗人Survivin 單克隆抗體和兔抗人β-actin抗體(1∶1 000)，4℃過夜，1×PBS洗膜3次，加AP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育雜交，室溫下30～60 min，加入顯色液顯色發(fā)光，掃描并分析條帶的吸光度值，結(jié)果以β-actin的光密度值作為參照。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制率和Western印跡檢測蛋白表達(dá)變化率(%)行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞變化 利用慢病毒lentivirus-CA9成功轉(zhuǎn)染ccRCC 786-O細(xì)胞，72 h后熒光顯微鏡下觀察，可見轉(zhuǎn)染成功的786-O細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不發(fā)熒光，慢病毒轉(zhuǎn)染后90%以上細(xì)胞發(fā)出綠色熒光表明病毒轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染效率高，見圖1。

2.2RCC786-O細(xì)胞活性及凋亡變化 轉(zhuǎn)染抑制CA9蛋白表達(dá)后ccRCC 786-O細(xì)胞的生長增殖活性受到明顯抑制，凋亡細(xì)胞增加，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在72 h抑制效率達(dá)到最大，比786-O組增殖活力降低61%(P<0.05)。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞凋亡增加(23.4±2)%(P<0.05)。見圖2。

圖1 光鏡和熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染ccRCC 786-O細(xì)胞(×200)

1)P<0.05,2)P<0.01

圖3 Western印跡條帶顯示CA9蛋白、Survivin蛋白、β-actin蛋白表達(dá)情況

2.3Western印跡檢測 如圖3所示，通過慢病毒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞抑制CA9蛋白的表達(dá)，其蛋白抑制效率為(75.2±2)%(P<0.05)。在CA9蛋白表達(dá)被抑制后Survivin蛋白水平也出現(xiàn)下降，其蛋白表達(dá)下降達(dá)到(43.1±3)%(P<0.05)。

3 討 論

RCC的生物學(xué)特性復(fù)雜，對放化療均不敏感，以手術(shù)治療為主〔4，5〕。RCC發(fā)生的確切病因與發(fā)病機制仍不清楚，近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速進(jìn)展，為RCC的診斷和治療及預(yù)后判斷提供了更好的方法。

CA9是由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，最早在腫瘤相關(guān)的Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶-9(CAIX)為其表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)于95%的ccRCC。CAIX是一種由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，是大多數(shù)RCC中都存在的VHL基因介導(dǎo)表達(dá)的酶，可以作為診斷性組織源性標(biāo)志物，由HIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合體介導(dǎo)，在ccRCC中由于VHL失活而表達(dá)上調(diào)〔3〕。CA9是診斷RCC最有效的分子標(biāo)志物之一〔6〕，許多學(xué)者已經(jīng)在多種腫瘤中研究了CA9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CA9與患者預(yù)后不良密切有關(guān)〔7〕。研究表明，轉(zhuǎn)移性ccRCC(N+/M+)中CA9的表達(dá)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的ccRCC(N0M0)；而在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組，CA9高表達(dá)組的生存率明顯低于低表達(dá)組〔8，9〕。以往研究多只對CA9進(jìn)行了臨床標(biāo)本檢測，少有對其體外研究報道，對CA9影響腎癌生長的信號通路也知之甚少。

本研究通過慢病毒lentivirus-CA9轉(zhuǎn)染腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞系，抑制CA9的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，786-O細(xì)胞的生長和增殖明顯受到了抑制，細(xì)胞凋亡率增加，提示CA9可能存在調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡的信號途徑。Survivin作為抗凋亡蛋白家族成員之一，當(dāng)期被認(rèn)為是最強的凋亡抑制因子，具有抑制Caspase-3的作用，這一蛋白家族抑制細(xì)胞凋亡的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于bcl-2家族的作用，在許多腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)〔10〕，可以通過多種途徑抑制凋亡，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，786-O細(xì)胞CA9被抑制后，Survivin蛋白的表達(dá)水平也隨之下降，考慮CA9基因可能通過調(diào)控Survivin表達(dá)變化從而影響ccRCC細(xì)胞的增殖和凋亡，但其具體的機制還需進(jìn)一步深入研究。

RCC確切病因與發(fā)病機制仍不清楚，盡管目前RCC根治術(shù)和腎部分切除術(shù)已成為治療早期RCC的有效手段，但在臨床上，小惡性實體腫瘤的出現(xiàn)率越來越高，而ccRCC占了全部RCC發(fā)生的80%以上，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時，已有1/3的腫瘤患者發(fā)生了轉(zhuǎn)移。因此，早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷RCC無論對于治療和預(yù)后都是至關(guān)重要的。通過本研究初步探討人CA9基因影響腎癌細(xì)胞生長的作用機制，為RCC的診斷和治療提供新的思路。

4 參考文獻(xiàn)

1Jemal A, Siegel R, Ward E,etal.Cancer statistics, 2007〔J〕.CA Cancer J Clin, 2007;57 (1):43-66.

2Ljungberg B, Campbell SC, Choi HY,etal.The epidemiology of renal cell carcinoma 〔J〕.Eur Urol, 2011;60(4):615-21.

3Patard JJ, Fergelot P, Karakiewicz PI,etal.Low CAIX expression and absence of VHL gene mutation are associated with tumor aggressiveness and poor survival of clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Int J Cancer,2008;123(2):395-400.

4Wright I, Kapoor A.Current systemic management of metastatic renal cell carcinoma-first line and second line therapy 〔J〕.Curr Opin Support Palliat Care, 2011;5(3):211-21.

5Zustovich F, Lombardi G, Nicoletto O,etal.Second-line therapy for refractory renal-cell carcinoma 〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol,2012;83(1):112-22.

6Barathova M, Takacova M, Holotnakova T,etal.Alternative splicing variant of the hypoxia marker carbonic anhydrase IX expressed independently of hypoxia and tumour phenotype 〔J〕.Br J Cancer, 2008;98(1):129-36.

7Malentacchi F, Simi L, Nannelli C,etal.Alternative splicing variants of carbonic anhydrase IX in human non-small cell lung cancer 〔J〕.Lung Cancer, 2009;64(3):271-6.

8Zhou GX, Ireland J, Rayman P,etal.Quantifiation of carbonic anhydrase IX expression in serum and tissue of renal cell carcinoma patients using enzyme-linked immunosorbent assay:prognostic and diagnostic potentials 〔J〕.Urology,2010;75(2):257-61.

9Wind TC, Messenger MP, Thompson D,etal.Measuring carbonic anhydrase IX as a hypoxia biomarker:differences in concentrations in serum and plasma using a commercial enzyme-linked immunosorbent assay due to influences of metal ions 〔J〕.Ann Clin Biochem,2011;48 (Pt 2):112-20.

10Shiozaki A, Kataoka K, Fujimura M,etal.Survivin inhibits apoptosis in cytotrophoblasts 〔J〕.Placenta, 2003；24(1):65-76.