南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科,江西 南昌 330006

PBEF在體外循環(huán)術(shù)后肺血管內(nèi)皮通透性中的機(jī)制研究

楊威董嘯周建良龔藝徐建軍

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科,江西 南昌 330006

目的探討PBEF在體外循環(huán)術(shù)后肺血管內(nèi)皮通透性增加中的機(jī)制，為提出更好的體外循環(huán)期間肺保護(hù)措施提供依據(jù)。方法建立動(dòng)物模型并進(jìn)行分組，A組僅行病毒轉(zhuǎn)染；B組僅行30min深低溫停循環(huán)；C組行病毒轉(zhuǎn)染后，再行30min深低溫停循環(huán)。應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織。結(jié)果C組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達(dá)明顯高于A、B組和對(duì)照組。結(jié)論P(yáng)BEF通過(guò)P38MAPK、ERK等途徑改變內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中MLC的磷酸化狀態(tài)，VE-cadherin和FAK也參與了肺血管內(nèi)皮通透性增加的過(guò)程。

前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子；體外循環(huán)；肺血管內(nèi)皮；通透性

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass, CPB)技術(shù)是心臟外科手術(shù)的必備條件,但其帶來(lái)的術(shù)后肺損傷等并發(fā)癥一直威脅著行心臟手術(shù)的患者，重者發(fā)展為呼吸窘迫綜合癥，甚至死亡，嚴(yán)重威脅到患者的生存和預(yù)后。前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(pre-B-cell colony enhancing factor, PBEF)作為一種具有生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶作用的分子，認(rèn)為PBEF在急性肺損傷中起到非常重要的作用。并參與調(diào)控炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮血管形成、心臟保護(hù)效應(yīng)和免疫應(yīng)答等多種作用。但具體機(jī)制仍不清楚，因此通過(guò)建立大鼠模型分析PBEF的作用機(jī)制，結(jié)果現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇體重在25～30g之間的成熟雄性昆明種小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(南昌大學(xué)心血管病研究所提供)，按不同處理方法分4組，每組10只，所有小鼠均在室溫(24±2)℃，濕度(55±5)%環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，如在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物死亡，選取新小鼠進(jìn)行補(bǔ)充。對(duì)照組動(dòng)物在麻醉后建立體外循環(huán)，不行體外循環(huán)轉(zhuǎn)流；A組動(dòng)物行慢病毒AD-PBEFshRNA轉(zhuǎn)染，在麻醉后建立體外循環(huán)，不行體外循環(huán)轉(zhuǎn)流；B組動(dòng)物在建立體外循環(huán)后進(jìn)行30min深低溫停循環(huán)；C組動(dòng)物行同種病毒轉(zhuǎn)染后，再進(jìn)行30min深低溫停循環(huán)。Western blot和免疫組化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法 大鼠處死后取右肺前葉用于肺組織濕干重比的測(cè)定，右肺中后葉留待Western blot、ELISA和免疫組化檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明分別進(jìn)行Western blot和ELISA檢測(cè)，Western blot檢測(cè)磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達(dá)。免疫組化檢測(cè)PBEF，鏡檢以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)[1]。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)結(jié)果 各組Western blot檢測(cè)結(jié)果見表1，C組磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達(dá)與A組、B組和對(duì)照組的差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。見表1。

2.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 A、B、C組在肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核及氣管粘膜上皮細(xì)胞均有廣泛的棕黃色顆粒，PBEF高表達(dá)。C組PBEF的表達(dá)明顯高于A、B組和對(duì)照組，表達(dá)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)；C組的PBEF表達(dá)與對(duì)照組的差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。見表2。

表1 各組Western blot檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

表2 各組免疫組化檢測(cè)PBEF結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3 討論

CPB技術(shù)隨著設(shè)備和技術(shù)的不斷進(jìn)步，CPB帶來(lái)的并發(fā)癥已逐漸減少，但CPB術(shù)后肺缺血再灌注損傷仍是CPB術(shù)后死亡的主要原因之一[2-3]。雖然多年的研究從多方面解釋了CPB術(shù)后肺損傷的產(chǎn)生原因，因此通過(guò)針對(duì)產(chǎn)生肺損傷的分子機(jī)制的靶向研究，以明確靶向分子在CPB術(shù)后中的作用，為開發(fā)新的治療策略和新的防治藥物提供一定的研究經(jīng)驗(yàn)。

PBEF作為B細(xì)胞早期分化的一種生長(zhǎng)因子，在炎癥細(xì)胞因子促進(jìn)延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞生存期的過(guò)程中，會(huì)明顯增多細(xì)胞內(nèi)PBEF的表達(dá)，在急性肺損傷動(dòng)物模型中研究顯示PBEF的血清、肺組織中的表達(dá)明顯增加[4]。本研究就是通過(guò)RNAi技術(shù)抑制組織PBEF的表達(dá)，通過(guò)降低PBEF的表達(dá)以減少Ca2+的流動(dòng)，改善內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，抵消炎癥細(xì)胞因子對(duì)中性粒細(xì)胞的抗凋亡作用[5-8]。C-1535T作為PBEF基因啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)生T變異會(huì)改變PBEF基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，降低PBEF的表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)而減少肺功能的損傷。本研究各組免疫組化檢測(cè)PBEF結(jié)果顯示，A、B、C組PBEF高表達(dá)，對(duì)照組PBEF低表達(dá)。PBEF過(guò)表達(dá)會(huì)延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)時(shí)間，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen一aetivatedproteinkinas, MAPK)途徑誘導(dǎo)炎癥因子的大量釋放，加重肺損傷。MAPK主要包括P38MAPK和ERK，磷酸化P38MAPK和ERK能夠通過(guò)多種胞內(nèi)信號(hào)途徑改變會(huì)影響細(xì)胞收縮功能，降低PBEF蛋白表達(dá)進(jìn)而改善凝血酶刺激造成的內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙[9]。本研究顯示C組磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE-cadherin、磷酸化FAK表達(dá)明顯高于A組、B組和對(duì)照組，由此可知通過(guò)抑制PBEF的表達(dá)，可間接影響MAPK途徑多種酶表達(dá)表達(dá)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)，在內(nèi)皮細(xì)胞間連接及血管內(nèi)皮的通透性調(diào)節(jié)上具有重要作用。VE-cadherin通過(guò)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞激酶激活PI3K，而FAK能夠激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。從研究結(jié)果來(lái)看VE-cadherin和FAK可能參與了肺血管內(nèi)皮通透性增加的過(guò)程[10]。

綜上所述，PBEF通過(guò)P38MAPK、ERK等途徑改變內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中MLC的磷酸化狀態(tài)，VE-cadherin和FAK也參與了肺血管內(nèi)皮通透性增加的過(guò)程，肺組織病理?yè)p害嚴(yán)重時(shí)VEGF、MMP2、MMP9呈現(xiàn)高表達(dá)。

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ResearchofthemechanismofPBEFinpulmonaryvascularendothelialpermeabilityincreasingafterCPB

YANG Wei，DONG Xiao，ZHOU Jian-linng，GONG Yi，XU Jian-jun

Surgery Department of the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nandang 330006,China

ObjectiveTo investigate the mechanism of PBEF in pulmonary vascular endothelial permeability increasing after CPB, in order to provide the basis for a better lung protective measures during cardiopulmonary bypass.MethodAnimal models were established, group A: the rats were transfected with the lentiviral AD-PBEFshRNA; group B: the rats were took 30min deep hypothermic circulatory arrest; group C: the rats were took 30min deep hypothermic circulatory arrest, then transfected with the lentiviral AD-PBEFshRNA. Lung tissue was detected with Western blot.ResultsPBEF, phosphorylation of P38MAPK, ERK, MLC, VE-cadherin, FAK in group C had significant difference with group A, B and the control group.ConclusionPBEF can change the phosphorylation state of the MLC in endothelial cells and smooth muscle cellsby P38MAPK, ERK pathway. VE-cadherin and FAK also involve in the process of pulmonary endothelial permeability increasing.

PBEF; cardiopulmanory bypass; pulmonary vascular endothelial; permeability

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2007G291212)資助；國(guó)家自然基金課題《前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子在體外循環(huán)術(shù)后肺血管內(nèi)皮通透性增加中的機(jī)制研究》資助，項(xiàng)目編號(hào)：81260054；國(guó)家自然基金《VEGF165/OPG 共價(jià)修飾去細(xì)胞瓣重構(gòu)介入心臟瓣膜的抗鈣化機(jī)制研究》資助，項(xiàng)目編號(hào)：81260047)

董嘯,主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：心胸外科。

R654.1

A

1007-8517(2014)19-0024-02

2014.08.09)