王少娟 林筱潔 尹利明 高瑞蘭

1浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所

七葉皂苷鈉誘導(dǎo)人單核白血病SHI-1細(xì)胞凋亡的研究

王少娟1林筱潔2尹利明2高瑞蘭2

1浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所

目的研究七葉皂苷鈉對(duì)人急性單核白血病細(xì)胞株SHI-1細(xì)胞的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。方法SHI-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的七葉皂苷鈉處理后，MTT法分析七葉皂苷鈉對(duì)SHI-1細(xì)胞增殖的抑制作用，AnnexinⅤ/PI染色流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，DNA凝膠電泳觀察凋亡特異性DNA降解梯形條帶，半定量PCR檢測(cè)凋亡特異性酶Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果MTT法顯示七葉皂苷鈉能顯著抑制SHI-1細(xì)胞的增殖，呈時(shí)間和劑量依賴性（P<0.05）。經(jīng)不同濃度的七葉皂苷鈉處理24h，AnnexinⅤ/PI染色顯示AnnexinⅤ陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞率明顯上升，DNA瓊脂糖凝膠電泳分析出現(xiàn)凋亡特異性的DNA降解梯形條帶，半定量PCR顯示Caspase-3 mRNA表達(dá)水平隨藥物濃度增加而升高（P<0.05）。結(jié)論七葉皂苷鈉對(duì)SHI-1細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，可能是其抗白血病作用途徑之一。

SHI-1細(xì)胞；凋亡；七葉皂苷鈉

七葉皂苷鈉（Sodium aescinate）是從七葉樹(shù)科中國(guó)天師栗Aesculus wilsonii Rehd、歐洲七葉樹(shù)Aesculus hippocastanum L、日本七葉樹(shù)Aesculus turbinate Blume和浙江七葉樹(shù)Aesculus chinensis Bunge var.chekiangensis，Hu et Fang干燥成熟果實(shí)娑羅子中提取的天然三糖苷類化合物的鈉鹽，具有具有消炎、抗?jié)B出、恢復(fù)毛細(xì)血管通透性、提高靜脈張力、改善血液循環(huán)、促進(jìn)腦功能恢復(fù)及神經(jīng)保護(hù)等作用[1]。七葉皂苷鈉在臨床上應(yīng)用廣泛，國(guó)內(nèi)主要用于治療腦水腫、腦梗死、顱腦外傷及肢體腫脹等疾病[2]。曾報(bào)到七葉皂苷鈉對(duì)白血病細(xì)胞株Jurkat、HL-60細(xì)胞有抑制增殖的作用，而且其作用呈時(shí)間和劑量依賴性[3-4]，但對(duì)侵襲性強(qiáng)的人單核白血病SHI-1細(xì)胞株的研究尚未報(bào)道。本研究觀察七葉皂苷鈉抑制SHI-1細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，為其抗白血病作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 SHI-1細(xì)胞 由江蘇省血液病研究所惠贈(zèng)。將人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株SHI-1細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，含青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100U/mL），置 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，以維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2 七葉皂苷鈉注射液 由綠葉制藥股份公司生產(chǎn)，從中藥天師栗的成熟果子中提取，批號(hào)：1208154。

1.3 儀 器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scientific公司）、移液器（法國(guó)Gilson公司）、普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek儀器公司）、FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 噻唑藍(lán)（MTT）比色實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期良好的SHI-1細(xì)胞，按5×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分別用 0、10、20、30、40、50mg/L 濃度的七葉皂苷鈉處理SHI-1細(xì)胞24、48h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加 DMSO 150μL，振蕩 10min，于酶標(biāo)儀上490nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度OD值，0mg/L濃度為對(duì)照組，下同。

2.2 AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 SHI-1細(xì)胞經(jīng) 0、10、20、30、40mg/L 濃度的七葉皂苷鈉處理24h，收獲細(xì)胞，冷PBS洗2次，加500μL結(jié)合緩沖液，混勻后加入5μL Annexin V-FITC和5μL PIFITC工作液，避光染色10min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.3 DNA ladder法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 SHI-1細(xì)胞經(jīng)0、10、20、30、40、50mg/L 濃 度 的 七 葉 皂 苷 鈉 處 理24h，收獲細(xì)胞，經(jīng)冷PBS洗滌后，加入細(xì)胞裂解液50μL（1mmol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl、1%NP-40，PH 7.5），1600g/min 離心，取上清，加入 RNase A（終濃度 100μg/mL）和 10%SDS（終濃度 1%SDS），56℃水浴2h。加入10mg/mL的蛋白酶K（終濃度250μg/mL），37℃水浴2h。然后采用1.2%瓊脂糖凝膠、電壓30V電泳5h。

2.4 半定量RT-PCR檢測(cè)Caspase-3mRNA表達(dá)SHI-1 細(xì)胞經(jīng) 0、10、20、30、40、50mg/L 濃度的七葉皂苷鈉處理24h，收獲細(xì)胞，經(jīng)冷PBS洗滌后，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度和純度，測(cè)A260/A280在1.8～2.0。RT-PCR反應(yīng)：cDNA的合成：根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。PCR擴(kuò)增混勻后置PCR儀上擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃變性 5min，隨后 94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min退出。Caspase-3 上游引物 5’-GAACTGGACTGTGGCATTGAG-3’，下游引物 5’-CAAAGCGACTGGATGAACCA-3’，產(chǎn)物為161bp，以β-actin為內(nèi)參。1.5%瓊脂糖電泳，拍照。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 七葉皂苷鈉對(duì)SHI-1細(xì)胞抑制增殖的作用 經(jīng)不同濃度七葉皂苷鈉處理SHI-1細(xì)胞24、48h后，細(xì)胞存活率呈時(shí)間和濃度依賴關(guān)系，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度七葉皂苷鈉在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHI-1細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 不同濃度七葉皂苷鈉在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHI-1細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別對(duì)照組七葉皂苷鈉組n/孔3 3 3 3 3 3濃度（mg/L）0 10 20 30 40 50 24h（A=490）1.06±0.02 0.96±0.03 0.90±0.01*0.68±0.00*0.48±0.02*0.30±0.01*48h（A=490）1.43±0.03 1.32±0.07 1.19±0.02*0.86±0.01*0.52±0.05*0.14±0.02*

3.2 七葉皂苷鈉對(duì)SHI-1細(xì)胞凋亡的影響

3.2.1 AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè) 10、20、30、40mg/L七葉皂苷處理SHI-1細(xì)胞20h后，Annexin-V細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組（P<0.05），且40mg/L濃度，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見(jiàn)表2。

表2 不同濃度七葉皂苷鈉對(duì)SHI-1細(xì)胞凋亡的影響（±s） %

表2 不同濃度七葉皂苷鈉對(duì)SHI-1細(xì)胞凋亡的影響（±s） %

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別對(duì)照組七葉皂苷鈉鈉組n/孔3 3 3 3 3濃度（mg/L）0 10 20 30 40早期凋亡率3.43±0.58 6.76±0.41*8.43±1.25*11.96±1.18*16.63±0.20*晚期凋亡率2.23±1.62 3.33±0.51*5.63±0.05*6.03±0.35*10.46±0.50*

3.2.2 DNA ladder法檢測(cè) 七葉皂苷處理SHI-1細(xì)胞24h后，30、40mg/L處理的SH-1細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的DNA梯形條帶，提示七葉皂苷可使細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活性增高，將核小體之間的DNA切割成180～200bp的多聚體，見(jiàn)圖1（封二）。

3.2.3 Caspase-3 mRNA表達(dá) 用半定量RT-PCR方法檢測(cè)caspase-3 mRNA含量，以β-actin作為內(nèi)參，見(jiàn)圖 2（封二）。

4 討論

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞在各種死亡信號(hào)刺激后發(fā)生的一系列瀑布式激活的主動(dòng)性死亡過(guò)程，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[5]。近年來(lái)，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療白血病研究的新方向。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉具有抑制SHI-1細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，抑制率呈時(shí)間和劑量依賴性。細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞膜的不對(duì)稱性消失，磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外，與鈣離子依賴性的磷脂結(jié)合蛋白Annexin V結(jié)合，故Annexin V可檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。碘化丙叮（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能穿過(guò)凋亡晚期和死細(xì)胞胞膜，使之著色，故Annexin V與PI匹配使用可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)[6]。研究顯示，40mg/L組早期凋亡率最高，而濃度到50mg/L組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明較低劑量的七葉皂苷能誘導(dǎo)SHI-1細(xì)胞凋亡，并與藥物呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，而較高劑量則具有殺傷白細(xì)胞的作用。細(xì)胞凋亡的一個(gè)典型特征是染色體DNA在核小體之間被切斷，產(chǎn)生的DNA長(zhǎng)度為180～200bp的整倍數(shù)，電泳呈梯形條帶[7]。本實(shí)驗(yàn)在30、40mg/L組顯示DNA降解梯形條帶。

細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，并與Caspase-3家族密切相關(guān)。Caspase為半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶的簡(jiǎn)稱，根據(jù)Caspase在凋亡中的作用分為兩大類：?jiǎn)?dòng)性Caspase和效應(yīng)性Caspase，Caspase-3即為效應(yīng)性Caspase，它除了參與細(xì)胞因子成熟，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化之外，還與細(xì)胞凋亡密切聯(lián)系。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞凋亡通路中處于重要地位，尤其是Caspase-3是其中的中心環(huán)節(jié)。Caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)Caspase成員中引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性激酶，也是細(xì)胞凋亡的主要參與成分[8]。七葉皂苷鈉通過(guò)何種途徑誘導(dǎo)人單核SHI-1細(xì)胞凋亡，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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Apoptosis of Human Acute Monocytic Leukemic SHI-1 Cells Induced by Sodium Aescinate

WANG Shao juan1,LIN Xiaojie2,YIN Liming2,GAO Ruilan2.1 Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310053),China;2 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University

ObjectiveTo investigate the effects of sodium aescinate on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of human acute monocytic leukemic SHI-1 cells.MethodsProliferation of sodium aescinate treated SHI-1 cells was detected by MTT method.The apoptosis rates of SHI-1 cells were analyzed by flow cytometry after annexinⅤ/PI staining.The gel electrophoresis of DNA ladder was used to analyze the bands of DNA degradation,and the expression level of caspase-3 mRNA was tested by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsMTT assay showed that the proliferation of SHI-1 cells was effectively inhibited by sodium aescinate in a time-and-does dependent manner（P<0.05）.The AnnexinⅤpositive rate of SHI-1 cells after treated with sodium aescinate was significantly increased by FCM analysis（P<0.05）.The apoptosis typical DNA fragments of SHI-1 cells treated with sodium aescinate was presented on the gel electrophoresis.The expression level of caspase-3 mRNA was up-regulated with increasing concentration of sodium aescinate by RT-PCR detection（P<0.05）.ConclusionTreatment with sodium aescinate can have inhibitory effect on proliferation and induce apoptosis of SHI-1 leukemia cells.Our results provides an experimental evidence for the activity of sodium aescinate on anti-leukemia.

SHI-1 cells；apoptosis sodium；aescinate

2013-07-21