肖 莉， 尤 榕

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

1955年Layrisse等[1]在委內(nèi)瑞拉1例新生兒溶血病患兒的母親血清中發(fā)現(xiàn)了抗Dia。12年后，其對(duì)偶的抗Dib發(fā)現(xiàn)。Dia和Dib都能引起輸血反應(yīng)和新生兒溶血病。1965年，Swangson等[2]在Dombrock(Do)女士血清中鑒定出一種抗體，對(duì)應(yīng)于一種新的抗原，即Doa;1973年Molthan等[3]鑒定出了他的對(duì)偶抗體抗Dob。Dombrock血型不合的輸血也可造成溶血性輸血反應(yīng)。在國(guó)際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)的命名中，Dombrook血型系統(tǒng)的編號(hào)為014。至今，Dombrock血型系統(tǒng)包括2個(gè)常見抗原Do1(Doa)和Do2(Dob)，以及其他3個(gè)高頻率抗原 Do3(Gya)、Do4(Hy)和 Do5(Joa)。隨著Do血型遺傳多態(tài)性的分子基礎(chǔ)被揭示，目前已開始使用分子生物學(xué)技術(shù)直接鑒定Do血型基因。我們以江西地區(qū)漢族隨機(jī)無償獻(xiàn)血者的DNA為檢材直接做Diego(Di)、Do血型基因分型，以取得相應(yīng)基因頻率的資料。

材料和方法

一、DNA樣本

取自江西地區(qū)200名漢族隨機(jī)無償獻(xiàn)血者，取300 μL ACD抗凝全血，使用TBG公司試劑盒抽提基因組DNA，DNA濃度在60 ng/μL左右，分離純化的DNA置－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

二、Di、Do 基因分型

采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCRSSP)技術(shù)特異性擴(kuò)增基因片段，使用深圳血液中心提供的分型試劑，分別鑒定Dia、Dib、Doa和Dob基因。所有基因特異性引物以及PCR反應(yīng)內(nèi)對(duì)照引物的序列見表1。

表1 分型特異性引物及內(nèi)對(duì)照引物序列

三、擴(kuò)增條件

1 μL DNA 標(biāo)本加1 μL Taq 酶(0.33 ～0.5 單位)，再加8 μL 引物混合物，總體積為10 μL，然后放在擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，條件為95℃ 5 min，95℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán) 30 次，72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物直接點(diǎn)樣于2%凝膠電泳，用TBE緩沖液電泳20 min，在紫外光下拍照記錄，每管都設(shè)有內(nèi)對(duì)照引物。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算2個(gè)血型系統(tǒng)的基因頻率，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

在200名無償獻(xiàn)血者中，Di血型查出2種基因表現(xiàn)型，分別為 Dia－b+196 例、Dia+b+4 例，Dia+b－及Dia－b－未檢出;Dia基因頻率為 0.01，Dib基因頻率為0.99。Dombrock血型查出3種基因表現(xiàn)型，分別為Doa+b－2例、Doa+b+16 例、Doa－b+182 例。Doa基因頻率為0.05，Dob基因頻率為0.95。χ2檢驗(yàn)顯示觀察值與期望值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，符合Hardy-Weinberg分布。見表2。

表2 江西地區(qū)漢族Di、Do血型分型結(jié)果

討 論

從80年代開始，血型的研究從使用血清學(xué)方法檢測(cè)血型抗原進(jìn)入以分子生物學(xué)基礎(chǔ)的新時(shí)代，逐步形成了檢測(cè)血型抗原基因頻率的新方法。國(guó)內(nèi)外早期對(duì)于紅細(xì)胞血型基因頻率的研究都是使用血清學(xué)方法，但是有些血型系統(tǒng)抗原的抗血清為稀有抗血清，難以獲得，價(jià)格不菲，從而使血清學(xué)方法存在局限性。而分子生物學(xué)方法檢測(cè)基因型準(zhǔn)確，成本低，而且不易受標(biāo)本保存期限的影響 ，因此幾乎可以完全替代血清學(xué)方法。

Di血型系統(tǒng)的Dia和Dib抗原均能引起輸血反應(yīng)和新生兒溶血病[1]。2種抗原相比較，Dia抗原有很強(qiáng)的表達(dá)，可以引起新生兒溶血病，而Dib抗原比較少見。因此在輸血反應(yīng)原因分析時(shí)應(yīng)考慮到Di血型系統(tǒng)的不配合性。本研究結(jié)果顯示江西地區(qū)Di血型表現(xiàn)型多數(shù)為Dia－b+(196例)、少數(shù)為 Dia+b+(4 例)，Dia+b－及 Dia－b－未檢出;Dia基因頻率為0.01，Dib基因頻率為 0.99，與文獻(xiàn)[4]報(bào)道相符。Dia+b－及Dia－b－未檢測(cè)出可能與本研究檢測(cè)標(biāo)本量較少有關(guān)，亦可能是本地區(qū)不存在這2種表現(xiàn)型，還有待于今后做進(jìn)一步驗(yàn)證。

Do血型不合的輸血也可造成溶血性輸血反應(yīng)，尚未見有自然發(fā)生的Do血型抗體?？笵oa、抗Dob、抗Gya和抗Hy一般都為IgG，均不結(jié)合補(bǔ)體。但抗Doa可以縮短Do血型不相容的輸入體內(nèi)紅細(xì)胞的生存期，并能引起速發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)?？笵ob可以引起速發(fā)型和遲發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)。本研究 Do血型表現(xiàn)型多數(shù)為 Doa－b+(186例)、少數(shù)為 Doa+b+(16例)和 Doa+b－(2例)。至今未見Do血型抗體不合引起的新生兒溶血病的報(bào)道。隨著方法學(xué)的建立和便于使用，也許會(huì)有更多的關(guān)于Do血型的臨床應(yīng)用研究。

[1]劉達(dá)莊.免疫血液學(xué)[M].上海:上?？萍汲霭嫔?，2002:81-82.

[2]Swanson J，Polesky HF.A'new'blood group antigen，Doa[J].Nature，1965，206:313.

[3]Molthan L，Crawford MN，Tippett P.Enlargement ofthe Dombrock blood group system:the finding of anti-Do b[J].Vox Sang，1973，24(4):382-384.

[4]劉孟黎，蔣冬玲，劉 晟.Diego血型基因在西安地區(qū)漢族人群中的頻率分布[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，24(4):348-349.