張海江，王向紅，毛宇豪，孫 佳

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

0 引言

食品在加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏和銷(xiāo)售過(guò)程中，會(huì)由于微生物污染導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)而造成重大經(jīng)濟(jì)損失。加入食品防腐劑是一種簡(jiǎn)單有效避免食品腐敗的方法[1]。食品防腐劑包括化學(xué)防腐劑、天然防腐劑和復(fù)合防腐劑，目前應(yīng)用以化學(xué)防腐劑為主。由于化學(xué)防腐劑有一定的毒副作用，對(duì)人體健康存在潛在的危害，近年來(lái)，隨著人們對(duì)食品安全要求的提高，天然防腐劑因其高效、安全的特點(diǎn)越來(lái)越受到世界各國(guó)的重視[2]。我國(guó)的天然防腐劑應(yīng)用有著幾千年的悠久歷史，主要以傳統(tǒng)中藥為基礎(chǔ)，不僅能夠防腐，還可賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味[3]。本文將系統(tǒng)研究肉桂、丁香、牛至等天然香辛料及其主要成分單體對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌和腐敗菌的體外抑制活性，并考察食物酸堿環(huán)境對(duì)抑菌活性的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效安全的天然防腐劑打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

藥品：肉桂醛(含量>98%)購(gòu)自湖北遠(yuǎn)程共創(chuàng)科技有限公司；肉桂油、丁香油、牛至油、丁香酚(含量>90%)、百里香酚(含量>98%)均購(gòu)自江西吉安華美植物油提煉廠。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室GC-MS和HPLC分析后，各藥品均質(zhì)量合格。除百里香酚精密配制為10%的DMSO溶液外，其余藥品均直接用于抑菌試驗(yàn)。

試劑：DMSO、KH2PO4、Na2HPO4均為分析純，超純水由實(shí)驗(yàn)室Millipore純水機(jī)自制。

1.2 菌種

致病菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、志賀菌(Shigella)

真菌：釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)

桿菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)

以上菌株均由淮安市商品檢驗(yàn)檢疫局檢疫中心提供。

1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基用于酵母菌的活化和計(jì)數(shù)；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)用于上述致病菌和枯草芽孢桿菌的活化和計(jì)數(shù)；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)用于上述致病菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)；麥芽浸粉肉湯(MEB)用于酵母菌的培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 儀器與設(shè)備

移液槍(雷勃，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)、恒溫?fù)u床(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、超聲波洗滌器(昆山市超聲儀器有限公司)、生物顯微鏡(上海長(zhǎng)方光電儀器廠)、pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、pH復(fù)合電極(上海盛磁儀器有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(太倉(cāng)精密儀器設(shè)備有限公司)

1.5 方法

1.5.1菌種的活化

無(wú)菌室中將供試菌株移接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，致病菌和桿菌均置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，釀酒酵母菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，以活化菌種[4]。0～4℃冷藏，留作備用。

1.5.2菌懸液的制備

取少量經(jīng)活化的待測(cè)菌種，置于裝有10 mL 的無(wú)菌水試管中，振蕩均勻，制成菌懸液。用無(wú)菌吸管取1.0 mL 充分混合的菌懸液加入裝有9.0 mL 無(wú)菌水的試管中，依次進(jìn)行稀釋?zhuān)詈笾瞥蓾舛葹?06～108個(gè)/mL的菌懸液，采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)[5]。

1.5.3培養(yǎng)基制備

分別準(zhǔn)確配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液和KH2PO4溶液，按體積比Na2HPO4：KH2PO4=12.3：87.7混合均勻，得pH=6的緩沖溶液[6]。分別以6 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值，得到pH=5和pH=7的緩沖溶液。分別溶解配制不同pH值的培養(yǎng)基溶液，并以6 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基溶液的pH值，并用pH計(jì)標(biāo)定，分別制得pH=5、pH=6和pH=7的培養(yǎng)基溶液。

1.5.4抑菌活性測(cè)定

1.5.4.1 濾紙片法

將高壓蒸汽滅菌過(guò)的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，移取50 μL菌懸液于上述培養(yǎng)基中，搖晃混合均勻后傾倒在相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，制成含菌平板。將厚度1.5 mm的濾紙用打孔機(jī)制成直徑為6 mm的小圓紙片，滅菌后分別浸于藥液和溶劑中2小時(shí)。瀝干后貼在含菌平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿中等距放置4片含藥濾紙片，倒置培養(yǎng)一定時(shí)間后，測(cè)定抑菌圈直徑。各菌株的培養(yǎng)溫度和時(shí)間分別為：致病菌和桿菌為37℃、24 h；釀酒酵母菌為28℃、48 h。各試驗(yàn)平行測(cè)定三次[7]。

1.5.4.2 溶液二倍稀釋法

(1)樣品溶液配制：取無(wú)菌試管排成一排。除第1管內(nèi)加入10 mL培養(yǎng)基溶液外，其余每管加入培養(yǎng)基溶液5 mL。準(zhǔn)確移取20 μL各供試精油和20 μL DMSO(助溶)加入至第1管中，超聲溶解均勻，得2 μL/mL的藥品溶液。從第一管中吸取5 mL含藥培養(yǎng)基溶液至第2管，超聲混勻后再吸取5 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋得到0.008～2 μL/mL的系列溶液[8]。

(2)陰性對(duì)照溶液的制備：試管中加入5 mL培養(yǎng)基，不加供試品。

(3)陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備：試管中加入5 mL培養(yǎng)基，按上述樣品溶液配制方法中的第1管加藥濃度加入供試品。

各試管塞好塞子，置蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min。取出冷卻后，分別向各管中加入受試菌懸液20 μL，每管最終受試菌的濃度約為105～106個(gè)/mL，陽(yáng)性對(duì)照溶液中不加菌。將接種好的試管置搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160 r/min。各類(lèi)菌的培養(yǎng)溫度、時(shí)間分別為：致病菌和桿菌37℃、24 h；釀酒酵母菌28℃、48 h。取出后，肉眼觀察各管的菌株生長(zhǎng)情況[9]。陽(yáng)性對(duì)照管溶液澄清透明表明滅菌完全，且培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)污染，陰性對(duì)照管溶液渾濁表明各菌株生長(zhǎng)良好。以澄清透明的供試藥品中最低濃度者為受試菌的MIC。各實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定三次。

1.5.4.3 pH值對(duì)抑菌效果的影響

大多數(shù)食品的酸堿環(huán)境為弱酸性和中性，即pH值5～7范圍。因此，本文按1.5.4.2二倍稀釋法，分別測(cè)定不同pH(5、6、7)條件下各藥品對(duì)各供試菌種的MIC值，考察pH值對(duì)各藥品體外抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙片法

各藥品的抑菌圈直徑見(jiàn)表1。

表1 幾種香辛料精油及單體的抑菌直徑(n=3)

抑菌圈判斷標(biāo)準(zhǔn)為：直徑大于1.5 cm為最敏感型，1.0～1.5 cm為中度敏感型，0.7～0.9 cm為低度敏感型，直徑小于0.7 cm為不敏感型[10]。由表1可知，各樣品對(duì)于常見(jiàn)的致病菌、桿菌、酵母菌均有良好的抑菌效果。其中，肉桂醛和肉桂油的抑菌效果最為明顯，除肉桂醛對(duì)大腸桿菌為中度敏感外，肉桂醛和肉桂油對(duì)其余的供試菌種的抑菌活性都屬于最敏感型；丁香油和丁香酚對(duì)沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌的抑菌活性為中度敏感型，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌的抑菌活性為最敏感型；牛至油和10%百里香酚對(duì)各供試菌種均顯示出中度敏感。

2.2 不同pH值下的二倍稀釋法測(cè)定結(jié)果

各香辛料精油及單體的最低抑菌濃度MIC見(jiàn)表2。

各香辛料精油及單體對(duì)各受試菌種均顯示出良好的體外抑制活性，三次平行試驗(yàn)所得MIC值一致。肉桂醛、丁香酚、百里香酚分別是肉桂油、丁香油和牛至油中的主要成分[11-13]。由表2可見(jiàn)，肉桂油與肉桂醛的MIC相近，二者表現(xiàn)出相似的抑菌活性，說(shuō)明肉桂醛為肉桂油中的主要抑菌成分，且肉桂油中存在其它抑菌活性物質(zhì)或其它成分與肉桂醛存在協(xié)同增效的作用。同樣的情況亦見(jiàn)于丁香油和丁香酚。而百里香酚的MIC均明顯小于牛至油，表明百里香酚的抑菌活性好于牛至油。在弱酸至中性條件下，肉桂、丁香精油及其單體的MIC值減小，尤其對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性明顯增強(qiáng)，表明酸度增大對(duì)于抑菌是有利的。牛至油及其單體百里香酚的MIC不隨pH波動(dòng)而改變，表明其體外抑菌活性與酸堿度無(wú)關(guān)。

表2 各香辛料精油及單體的MIC(n=3)

續(xù)表2 各香辛料精油及單體的MIC(n=3)

3 結(jié)論

研究肉桂、丁香和牛至精油及其單體對(duì)常見(jiàn)的食品致病菌和腐敗菌的體外抑菌作用，結(jié)果表明各精油及單體對(duì)各菌種均具有良好的體外抑菌活性，其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最強(qiáng)。肉桂醛和肉桂油對(duì)各供試菌種的MIC值為0.04～0.50 μL/mL；丁香油和丁香酚的MIC值為0.06～1.50μL/mL；牛至油和百里香酚的MIC值為0.06～1.00 μL/mL。在pH5～7的弱酸至中性條件下，隨著酸度增大，肉桂油、丁香油及其單體成分的體外抑菌活性有所增強(qiáng)。

肉桂、丁香、牛至是常見(jiàn)的天然香辛料，應(yīng)用歷史悠久，安全性好。本文研究表明這些香辛料精油及其單體具有良好的天然防腐劑開(kāi)發(fā)價(jià)值。

感謝淮安市商品檢驗(yàn)檢疫局檢疫中心為本項(xiàng)目提供受試菌株。

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