霍麗妮+陳睿+廖艷芳+劉華鋼+黃茂春+胡越

摘要:試驗(yàn)采用清除DPPH自由基?清除ABTS+自由基和還原能力3種體外抗氧化測定方法,對寄主為黃皮樹[Clausena lansium (Lour.) Skeels]的桑寄生(Taxillus chinensis)不同極性溶劑提取物的抗氧化能力進(jìn)行了研究?結(jié)果表明,黃皮桑寄生乙酸乙酯和正丁醇提取物具有較優(yōu)異的抗氧化能力,其結(jié)果與其有較高的總黃酮含量有關(guān)?說明黃皮桑寄生乙酸乙酯和正丁醇提取物具有較好的開發(fā)天然抗氧化劑的潛力?

關(guān)鍵詞:桑寄生(Taxillus chinensis);黃皮[Clausena lansium(Lour.) Skeels];抗氧化;寄主

中圖分類號:R284.2;Q946文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2014)11-2631-03

Antioxidant Activity of The Extracts from Taxillus chinensis Parasitized

on Clausena lansium (Lour.) Skeels

HUO Li-ni1,2,CHEN Rui3,LIAO Yan-fang4,LIU Hua-gang1,HUANG Mao-chun3,HU Yue3

(1.College of Pharmacy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 2.College of Pharmacy,Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530001, China; 3.College of Chinese Medical Science, Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning 530022, China; 4.Guangxi Institute of Chemical Industry, Nanning 530001, China)

Abstract: Three in vitro antioxidant methods such as DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) and ABTS+ (2,2＇-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) scavenging assay and reducing assay were used to study the antioxidant ability of the petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol extracts from Taxillus chinensis parasitized on Clausena lansium (Lour.) Skeels. The total flavonoids(TF) in all extracts were determined by UV methods. The results showed that the ethyl acetate extracts(EE) and n-butanol extracts(BE) had better antioxidant ability which might related with its high content of total flavonoids. It is indicated that EE and BE have good development potential for natural antioxidant.

Key words: Taxillus chinensis; Clausena lansium (Lour.) Skeels; antioxidant; host

基金項(xiàng)目:廣西教育廳課題項(xiàng)目(2013YB137;2013LX063);廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥民族醫(yī)藥繼承創(chuàng)新工程課題項(xiàng)目(GZZC13-01;GZZC13-02)

中藥桑寄生為桑寄生科鈍果寄生屬植物桑寄生(Taxillus chinensis)的干燥帶葉莖枝,主產(chǎn)于廣東?廣西?云南?福建等地,具有補(bǔ)肝腎?強(qiáng)筋骨?祛風(fēng)濕?安胎元等功效,用于治療風(fēng)濕痹痛?腰膝酸軟?筋骨無力?崩漏經(jīng)多?妊娠漏血?胎動不安等癥[1]?桑寄生科植物具有特殊的半寄生性適應(yīng)特點(diǎn),寄主通常并不限于某一物種,桑寄生寄主植物可能多達(dá)數(shù)十種?目前,藥材桑寄生基本為野生,采自于不同寄主和不同的寄生品種,藥材來源復(fù)雜,但這些來源于不同寄主的桑寄生在植物形態(tài)上并無差異?研究表明[2],生長在不同寄主上的同種寄生,雖然其外部形態(tài)相同,但其藥效和毒性卻不相同,尤其像生長在馬桑樹?漆樹等有毒寄主上的寄生亦是有毒的,應(yīng)作為有毒藥材使用,而不能作為中藥桑寄生使用?迄今為止,不同寄主誘導(dǎo)寄生植物的藥效及化學(xué)成分所產(chǎn)生的變化已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注?有文獻(xiàn)[3]報(bào)道黃皮樹[Clausena lansium (Lour.) Skeels]樹皮具有良好的抗氧化活性,因此寄生于黃皮樹上的桑寄生被認(rèn)為可作為抗氧化物的天然來源之一,目前對寄主為黃皮樹的桑寄生的抗氧化性方面的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道?本試驗(yàn)采用DPPH?ABTS+自由基清除能力和還原能力等3種體外抗氧化測定方法,對寄主為黃皮樹的桑寄生不同極性溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行了考察,并以化學(xué)合成抗氧化劑BHT作陽性對照,對比它們的抗氧化性,以期尋找到安全?可靠的抗氧化物質(zhì),為進(jìn)一步探索寄主對寄生植物藥理活性的影響提供了一定的理論基礎(chǔ)?

1材料與方法

1.1材料?儀器與試劑

材料:試驗(yàn)用桑寄生經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院韋松基教授鑒定為桑寄生科鈍果寄生屬(Taxillus chinensis Danser),其寄主為蕓香科黃皮屬植物黃皮樹[Clausena lansium(Lour.)Skeels]?桑寄生全株自然晾干,粉碎?

儀器:8453型紫外可見分光光度計(jì)(美國安捷倫);BS224S型電子天平(德國賽多利斯);RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)?

試劑:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)?ABTS [2,2′-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]以及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品均為美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品; BHT(2,6-二叔丁基對甲酚),上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純?

1.2方法

1.2.1黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物的制備稱取黃皮桑寄生粗粉500 g,室溫下用4 L 95%乙醇冷浸提取48 h,過濾后濾渣加等量溶劑同法再提取2次,過濾,合并3次濾液?回收溶劑,將所得浸膏分散于水中,分別用石油醚?乙酸乙酯和正丁醇萃取,減壓除去溶劑后,分別得石油醚提取物(PE)?乙酸乙酯提取物(EE)?正丁醇提取物(BE),各提取物得率分別為8.09%?20.86%?28.00%?

1.2.2黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物樣品液的制備先分別稱取PE?EE?BE和陽性對照BHT各0.2 g于燒杯中,95%乙醇溶解后,定容至25 mL容量瓶中,配成8 mg/mL儲備液;再將該儲備液用95%乙醇分別稀釋成7個(gè)濃度(0.2?0.5?0.8?1.2?1.5?1.8和2.0 mg/mL)的待測液?

1.2.3黃皮桑寄生總黃酮含量的測定精密吸取0.0?0.5?1.0?2.0?3.0?4.0?5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(l.2 mg/mL)于7個(gè)10 mL容量瓶中,分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL,靜置6 min;加入5%硝酸鋁0.4 mL,靜置6 min;加5%氫氧化鈉試液4.0 mL,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻,靜置15 min,在510 nm處測定吸光度?以吸光度為縱坐標(biāo)(y),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=11.141x-0.022 5,R2=0.998 5?將0.8 mg/mL的各提取物溶液按照以上操作分別測定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮含量?

1.2.4黃皮桑寄生清除DPPH自由基的能力測定[4]分別取“1.2.2”中配制的不同濃度(0.2~2.0 mg/mL)的黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物待測液0.10 mL,加入4mL 0.004% DPPH溶液中,25 ℃下放置10 min,以不加提取物溶液的DPPH溶液為空白對照,以相同濃度BHT為陽性對照,在最大波長處(515 nm)測其吸光度,試驗(yàn)平行進(jìn)行3次,結(jié)果取平均值?根據(jù)下列公式計(jì)算不同濃度各提取物溶液對DPPH自由基的清除率?

DPPH清除率=(1-A1/A0)×100%

式中,A1為加各提取物溶液或BHT后DPPH溶液的吸光度;A0為未加提取物溶液或BHT時(shí)DPPH溶液的吸光度?

1.2.5黃皮桑寄生清除ABTS+自由基的能力測定[5] 用去離子水將ABTS配制成7 mmol/L準(zhǔn)備液,然后往準(zhǔn)備液中加入過硫酸鉀固體,使此準(zhǔn)備液的過硫酸鉀濃度為2.45 mmol/L?室溫避光放置2 d備用?將ABTS溶液用2 mmol/L PBS緩沖液(pH7.4)稀釋,使其在732 nm下測得吸光度在(0.7±0.05),將20 μL不同濃度各提取物溶液與1.9 mL ABTS溶液混合,以不加提取物溶液的ABTS溶液作為參比,以相同濃度BHT為陽性對照,在室溫下放置3 min后測其吸光度?按下列公式計(jì)算ABTS+自由基清除率?

ABTS+自由基清除率=[(A0-A1)/A1)]×100%

式中,A0為未加各提取物溶液或BHT的ABTS溶液的吸光度?A1為加各提取物溶液或BHT的ABTS溶液的吸光度?

1.2.6還原能力測定[6] 取0.2 mL不同濃度(0.2~2.0 mg/mL)黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物溶液,加入2.5 mL 2 mmol/L PBS緩沖液(pH 6.6),2.5 mL 1% K4Fe(CN)6溶液?上述混合物于50 ℃水浴保溫20 min后,取出試管速冷,加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液,4 000 r/min離心10 min?取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水,0.5 mL 1%FeCl3溶液,混勻?以不加提取物溶液作為空白參比,在700 nm處測定其吸光度?

2結(jié)果與分析

2.1黃皮桑寄生總黃酮含量測定

黃酮類化合物是植物中的主要抗氧化成分,黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物的總黃酮含量見表1?由表1可知,在黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物中,以正丁醇提取物(BE)的總黃酮含量最高,為(107.04±2.61)mg/g,各提取物總黃酮含量排序?yàn)锽E>EE>PE?

2.2對DPPH自由基的清除能力

黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物與BHT清除DPPH自由基的能力對比結(jié)果見圖1?從圖1可看出,PE對DPPH自由基幾乎無任何清除能力,EE和BE對DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除作用,在濃度為0.8~2.0 mg/mL時(shí),其對DPPH的清除率是陽性對照BHT的近2倍?用IC50表示自由基被清除一半時(shí)抗氧化劑的濃度,經(jīng)過計(jì)算得出BE?EE?PE的IC50分別為(0.73±0.03)?(1.11±0.03)?(325.13±5.2)mg/mL?3種提取物與BHT清除DPPH自由基的能力排序?yàn)锽E>EE>BHT>PE?

2.3對ABTS+自由基的清除能力

ABTS+自由基清除率越大,表明其抗氧化活性越強(qiáng),反之則弱?黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物與BHT清除ABTS+自由基的能力對比結(jié)果見圖2?由圖2可看出,PE對ABTS+自由基的清除率極低,在其濃度范圍內(nèi)均未超過5%;EE和BE均具有較好地清除ABTS+自由基的能力,其清除率與其濃度成正比,最高可達(dá)94.7%,但在相同濃度下,EE和BE對ABTS+自由基的清除效果均弱于陽性對照BHT?經(jīng)計(jì)算得出PE?EE?BE的IC50分別為(209.33±5.130)?(0.84±0.043)?(1.32±0.047)mg/mL,3種提取物清除ABTS+自由基的能力排序?yàn)镋E>BE>PE?

2.4還原能力

由圖3可知,黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物均具有還原能力,在所測濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系?在3種提取物中,EE表現(xiàn)出最強(qiáng)的還原能力?EE和BE的還原能力均遠(yuǎn)高于PE,但相同濃度下均低于BHT?用EC50值(吸光度達(dá)到0.5時(shí)的有效濃度)表示各提取物的還原能力,EC50值越低則其還原能力越強(qiáng)?結(jié)果表明,EE?BE?PE的EC50值分別為(0.53±0.02)?(0.80±0.03)?(30.52±2.93) mg/mL,3種提取物還原能力排序?yàn)镋E>BE>PE?

3結(jié)論

綜合試驗(yàn)結(jié)果可知,黃皮桑寄生乙酸乙酯和正丁醇提取物對DPPH自由基?ABTS+自由基的清除以及還原能力3種體外抗氧化體系均表現(xiàn)出良好的活性,且其活性均隨濃度增加而加強(qiáng),該結(jié)果與這兩種提取物有較高的總黃酮含量相一致?表明其抗氧化活性可能與其所含的黃酮類成分有關(guān)?此外,寄主黃皮樹為廣西常見植物,本研究也為不同寄主的桑寄生植物的生物活性與化學(xué)成分差異的研究奠定了良好的基礎(chǔ)?

參考文獻(xiàn):

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 龔祝南, 余國奠, 吳家榮,等. 四川西部桑寄生的調(diào)查研究[J].中草藥,1984, 15(4):35.

[3] PRASAD K N, HAO J, YI C,et al. Antioxidant and anticancer activities of wampee (Clausena lansium (Lour.) Skeels) peel [J]. J Biomed Biotechno,2009(10):1155-1161.

[4] RE R, PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay [J]. Free Radical Bio Med, 1999,26(9-10): 1231-1237.

[5] KIM D O, LEE K W, LEE H J, et a1. Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals [J]. J Agric Food Chem, 2002,50 (13): 3713-3717.

[6] MAZOR D, GREENBERG L, SHAMIR D, et al. Antioxidant properties of bucillamine: Possible mode of action [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 349(3): 1171-1175.

1.2.3黃皮桑寄生總黃酮含量的測定精密吸取0.0?0.5?1.0?2.0?3.0?4.0?5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(l.2 mg/mL)于7個(gè)10 mL容量瓶中,分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL,靜置6 min;加入5%硝酸鋁0.4 mL,靜置6 min;加5%氫氧化鈉試液4.0 mL,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻,靜置15 min,在510 nm處測定吸光度?以吸光度為縱坐標(biāo)(y),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=11.141x-0.022 5,R2=0.998 5?將0.8 mg/mL的各提取物溶液按照以上操作分別測定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮含量?

1.2.4黃皮桑寄生清除DPPH自由基的能力測定[4]分別取“1.2.2”中配制的不同濃度(0.2~2.0 mg/mL)的黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物待測液0.10 mL,加入4mL 0.004% DPPH溶液中,25 ℃下放置10 min,以不加提取物溶液的DPPH溶液為空白對照,以相同濃度BHT為陽性對照,在最大波長處(515 nm)測其吸光度,試驗(yàn)平行進(jìn)行3次,結(jié)果取平均值?根據(jù)下列公式計(jì)算不同濃度各提取物溶液對DPPH自由基的清除率?

DPPH清除率=(1-A1/A0)×100%

式中,A1為加各提取物溶液或BHT后DPPH溶液的吸光度;A0為未加提取物溶液或BHT時(shí)DPPH溶液的吸光度?

1.2.5黃皮桑寄生清除ABTS+自由基的能力測定[5] 用去離子水將ABTS配制成7 mmol/L準(zhǔn)備液,然后往準(zhǔn)備液中加入過硫酸鉀固體,使此準(zhǔn)備液的過硫酸鉀濃度為2.45 mmol/L?室溫避光放置2 d備用?將ABTS溶液用2 mmol/L PBS緩沖液(pH7.4)稀釋,使其在732 nm下測得吸光度在(0.7±0.05),將20 μL不同濃度各提取物溶液與1.9 mL ABTS溶液混合,以不加提取物溶液的ABTS溶液作為參比,以相同濃度BHT為陽性對照,在室溫下放置3 min后測其吸光度?按下列公式計(jì)算ABTS+自由基清除率?

ABTS+自由基清除率=[(A0-A1)/A1)]×100%

式中,A0為未加各提取物溶液或BHT的ABTS溶液的吸光度?A1為加各提取物溶液或BHT的ABTS溶液的吸光度?

1.2.6還原能力測定[6] 取0.2 mL不同濃度(0.2~2.0 mg/mL)黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物溶液,加入2.5 mL 2 mmol/L PBS緩沖液(pH 6.6),2.5 mL 1% K4Fe(CN)6溶液?上述混合物于50 ℃水浴保溫20 min后,取出試管速冷,加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液,4 000 r/min離心10 min?取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水,0.5 mL 1%FeCl3溶液,混勻?以不加提取物溶液作為空白參比,在700 nm處測定其吸光度?

2結(jié)果與分析

2.1黃皮桑寄生總黃酮含量測定

黃酮類化合物是植物中的主要抗氧化成分,黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物的總黃酮含量見表1?由表1可知,在黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物中,以正丁醇提取物(BE)的總黃酮含量最高,為(107.04±2.61)mg/g,各提取物總黃酮含量排序?yàn)锽E>EE>PE?

2.2對DPPH自由基的清除能力

黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物與BHT清除DPPH自由基的能力對比結(jié)果見圖1?從圖1可看出,PE對DPPH自由基幾乎無任何清除能力,EE和BE對DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除作用,在濃度為0.8~2.0 mg/mL時(shí),其對DPPH的清除率是陽性對照BHT的近2倍?用IC50表示自由基被清除一半時(shí)抗氧化劑的濃度,經(jīng)過計(jì)算得出BE?EE?PE的IC50分別為(0.73±0.03)?(1.11±0.03)?(325.13±5.2)mg/mL?3種提取物與BHT清除DPPH自由基的能力排序?yàn)锽E>EE>BHT>PE?

2.3對ABTS+自由基的清除能力

ABTS+自由基清除率越大,表明其抗氧化活性越強(qiáng),反之則弱?黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物與BHT清除ABTS+自由基的能力對比結(jié)果見圖2?由圖2可看出,PE對ABTS+自由基的清除率極低,在其濃度范圍內(nèi)均未超過5%;EE和BE均具有較好地清除ABTS+自由基的能力,其清除率與其濃度成正比,最高可達(dá)94.7%,但在相同濃度下,EE和BE對ABTS+自由基的清除效果均弱于陽性對照BHT?經(jīng)計(jì)算得出PE?EE?BE的IC50分別為(209.33±5.130)?(0.84±0.043)?(1.32±0.047)mg/mL,3種提取物清除ABTS+自由基的能力排序?yàn)镋E>BE>PE?

2.4還原能力

由圖3可知,黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物均具有還原能力,在所測濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系?在3種提取物中,EE表現(xiàn)出最強(qiáng)的還原能力?EE和BE的還原能力均遠(yuǎn)高于PE,但相同濃度下均低于BHT?用EC50值(吸光度達(dá)到0.5時(shí)的有效濃度)表示各提取物的還原能力,EC50值越低則其還原能力越強(qiáng)?結(jié)果表明,EE?BE?PE的EC50值分別為(0.53±0.02)?(0.80±0.03)?(30.52±2.93) mg/mL,3種提取物還原能力排序?yàn)镋E>BE>PE?

3結(jié)論

綜合試驗(yàn)結(jié)果可知,黃皮桑寄生乙酸乙酯和正丁醇提取物對DPPH自由基?ABTS+自由基的清除以及還原能力3種體外抗氧化體系均表現(xiàn)出良好的活性,且其活性均隨濃度增加而加強(qiáng),該結(jié)果與這兩種提取物有較高的總黃酮含量相一致?表明其抗氧化活性可能與其所含的黃酮類成分有關(guān)?此外,寄主黃皮樹為廣西常見植物,本研究也為不同寄主的桑寄生植物的生物活性與化學(xué)成分差異的研究奠定了良好的基礎(chǔ)?

參考文獻(xiàn):

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 龔祝南, 余國奠, 吳家榮,等. 四川西部桑寄生的調(diào)查研究[J].中草藥,1984, 15(4):35.

[3] PRASAD K N, HAO J, YI C,et al. Antioxidant and anticancer activities of wampee (Clausena lansium (Lour.) Skeels) peel [J]. J Biomed Biotechno,2009(10):1155-1161.

[4] RE R, PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay [J]. Free Radical Bio Med, 1999,26(9-10): 1231-1237.

[5] KIM D O, LEE K W, LEE H J, et a1. Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals [J]. J Agric Food Chem, 2002,50 (13): 3713-3717.

[6] MAZOR D, GREENBERG L, SHAMIR D, et al. Antioxidant properties of bucillamine: Possible mode of action [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 349(3): 1171-1175.

1.2.3黃皮桑寄生總黃酮含量的測定精密吸取0.0?0.5?1.0?2.0?3.0?4.0?5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(l.2 mg/mL)于7個(gè)10 mL容量瓶中,分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL,靜置6 min;加入5%硝酸鋁0.4 mL,靜置6 min;加5%氫氧化鈉試液4.0 mL,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻,靜置15 min,在510 nm處測定吸光度?以吸光度為縱坐標(biāo)(y),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=11.141x-0.022 5,R2=0.998 5?將0.8 mg/mL的各提取物溶液按照以上操作分別測定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總黃酮含量?

1.2.4黃皮桑寄生清除DPPH自由基的能力測定[4]分別取“1.2.2”中配制的不同濃度(0.2~2.0 mg/mL)的黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物待測液0.10 mL,加入4mL 0.004% DPPH溶液中,25 ℃下放置10 min,以不加提取物溶液的DPPH溶液為空白對照,以相同濃度BHT為陽性對照,在最大波長處(515 nm)測其吸光度,試驗(yàn)平行進(jìn)行3次,結(jié)果取平均值?根據(jù)下列公式計(jì)算不同濃度各提取物溶液對DPPH自由基的清除率?

DPPH清除率=(1-A1/A0)×100%

式中,A1為加各提取物溶液或BHT后DPPH溶液的吸光度;A0為未加提取物溶液或BHT時(shí)DPPH溶液的吸光度?

1.2.5黃皮桑寄生清除ABTS+自由基的能力測定[5] 用去離子水將ABTS配制成7 mmol/L準(zhǔn)備液,然后往準(zhǔn)備液中加入過硫酸鉀固體,使此準(zhǔn)備液的過硫酸鉀濃度為2.45 mmol/L?室溫避光放置2 d備用?將ABTS溶液用2 mmol/L PBS緩沖液(pH7.4)稀釋,使其在732 nm下測得吸光度在(0.7±0.05),將20 μL不同濃度各提取物溶液與1.9 mL ABTS溶液混合,以不加提取物溶液的ABTS溶液作為參比,以相同濃度BHT為陽性對照,在室溫下放置3 min后測其吸光度?按下列公式計(jì)算ABTS+自由基清除率?

ABTS+自由基清除率=[(A0-A1)/A1)]×100%

式中,A0為未加各提取物溶液或BHT的ABTS溶液的吸光度?A1為加各提取物溶液或BHT的ABTS溶液的吸光度?

1.2.6還原能力測定[6] 取0.2 mL不同濃度(0.2~2.0 mg/mL)黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物溶液,加入2.5 mL 2 mmol/L PBS緩沖液(pH 6.6),2.5 mL 1% K4Fe(CN)6溶液?上述混合物于50 ℃水浴保溫20 min后,取出試管速冷,加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液,4 000 r/min離心10 min?取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水,0.5 mL 1%FeCl3溶液,混勻?以不加提取物溶液作為空白參比,在700 nm處測定其吸光度?

2結(jié)果與分析

2.1黃皮桑寄生總黃酮含量測定

黃酮類化合物是植物中的主要抗氧化成分,黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物的總黃酮含量見表1?由表1可知,在黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物中,以正丁醇提取物(BE)的總黃酮含量最高,為(107.04±2.61)mg/g,各提取物總黃酮含量排序?yàn)锽E>EE>PE?

2.2對DPPH自由基的清除能力

黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物與BHT清除DPPH自由基的能力對比結(jié)果見圖1?從圖1可看出,PE對DPPH自由基幾乎無任何清除能力,EE和BE對DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除作用,在濃度為0.8~2.0 mg/mL時(shí),其對DPPH的清除率是陽性對照BHT的近2倍?用IC50表示自由基被清除一半時(shí)抗氧化劑的濃度,經(jīng)過計(jì)算得出BE?EE?PE的IC50分別為(0.73±0.03)?(1.11±0.03)?(325.13±5.2)mg/mL?3種提取物與BHT清除DPPH自由基的能力排序?yàn)锽E>EE>BHT>PE?

2.3對ABTS+自由基的清除能力

ABTS+自由基清除率越大,表明其抗氧化活性越強(qiáng),反之則弱?黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物與BHT清除ABTS+自由基的能力對比結(jié)果見圖2?由圖2可看出,PE對ABTS+自由基的清除率極低,在其濃度范圍內(nèi)均未超過5%;EE和BE均具有較好地清除ABTS+自由基的能力,其清除率與其濃度成正比,最高可達(dá)94.7%,但在相同濃度下,EE和BE對ABTS+自由基的清除效果均弱于陽性對照BHT?經(jīng)計(jì)算得出PE?EE?BE的IC50分別為(209.33±5.130)?(0.84±0.043)?(1.32±0.047)mg/mL,3種提取物清除ABTS+自由基的能力排序?yàn)镋E>BE>PE?

2.4還原能力

由圖3可知,黃皮桑寄生不同極性溶劑提取物均具有還原能力,在所測濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系?在3種提取物中,EE表現(xiàn)出最強(qiáng)的還原能力?EE和BE的還原能力均遠(yuǎn)高于PE,但相同濃度下均低于BHT?用EC50值(吸光度達(dá)到0.5時(shí)的有效濃度)表示各提取物的還原能力,EC50值越低則其還原能力越強(qiáng)?結(jié)果表明,EE?BE?PE的EC50值分別為(0.53±0.02)?(0.80±0.03)?(30.52±2.93) mg/mL,3種提取物還原能力排序?yàn)镋E>BE>PE?

3結(jié)論

綜合試驗(yàn)結(jié)果可知,黃皮桑寄生乙酸乙酯和正丁醇提取物對DPPH自由基?ABTS+自由基的清除以及還原能力3種體外抗氧化體系均表現(xiàn)出良好的活性,且其活性均隨濃度增加而加強(qiáng),該結(jié)果與這兩種提取物有較高的總黃酮含量相一致?表明其抗氧化活性可能與其所含的黃酮類成分有關(guān)?此外,寄主黃皮樹為廣西常見植物,本研究也為不同寄主的桑寄生植物的生物活性與化學(xué)成分差異的研究奠定了良好的基礎(chǔ)?

參考文獻(xiàn):

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 龔祝南, 余國奠, 吳家榮,等. 四川西部桑寄生的調(diào)查研究[J].中草藥,1984, 15(4):35.

[3] PRASAD K N, HAO J, YI C,et al. Antioxidant and anticancer activities of wampee (Clausena lansium (Lour.) Skeels) peel [J]. J Biomed Biotechno,2009(10):1155-1161.

[4] RE R, PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay [J]. Free Radical Bio Med, 1999,26(9-10): 1231-1237.

[5] KIM D O, LEE K W, LEE H J, et a1. Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals [J]. J Agric Food Chem, 2002,50 (13): 3713-3717.

[6] MAZOR D, GREENBERG L, SHAMIR D, et al. Antioxidant properties of bucillamine: Possible mode of action [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 349(3): 1171-1175.