李辰晨 吳建中 王卓 馮繼鋒

肺癌是死亡率較高的一種惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)每年因肺癌而死亡的人數(shù)大約有100萬[1]。目前在肺癌的治療策略方面取得了一定的進(jìn)步，但患者5年生存率仍然只有15%[2]。隨著近幾年發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中含有表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突變的比例增高，肺癌的治療策略也隨之發(fā)生了巨大變化[3,4]。酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）能夠特異性地抑制突變的EGFR蛋白，如吉非替尼和厄洛替尼。

在2011年中國版有關(guān)NSCLC的美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南中，根據(jù)最新的III期隨機(jī)研究，如IPASS、First-SIGNAL、WJTOG3405、OPTIMAL治療，TKIs已作為一線治療方案，并且EGFR活化突變的存在對(duì)一些合適的患者的選擇是一個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)因素[5-11]。因此，在中國很多醫(yī)院，EGFR突變分析已成為一種常規(guī)的分子檢測(cè)項(xiàng)目。并且直接測(cè)序法是最常用的的方法，因?yàn)橐撰@得，與實(shí)時(shí)PCR分析法（如TaqMan探針）、ARMS法和HRM法相比，直接測(cè)序法相對(duì)價(jià)格便宜。

眾所周知，腫瘤組織是EGFR突變分析的最佳DNA資源。然而，大多數(shù)NSCLC患者處于晚期不能手術(shù)，足夠的腫瘤組織不易獲得。例如，在IPASS研究中，只有36%（437/1,217）患者有組織活檢標(biāo)本適用于檢測(cè)。在INTEREST研究中，這個(gè)比例僅為20%（297/1,466）[5,12]。相反，體液的獲取通常很容易，創(chuàng)傷小，且可重復(fù)，例如胸水和血漿[13-18]。然而，使用體液的突變的測(cè)試程序還需要進(jìn)行優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證的。

本研究通過直接測(cè)序法和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）方法（ADx-EGFR 29，廈門艾德公司）來比較不同來源的腫瘤組織標(biāo)本（包括新鮮組織、石蠟組織及胸水）的EGFR基因中18-21外顯子的突變情況。

1 材料和方法

1.1 材料 收集自2012年4月-2013年6月本中心接受進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)的NSCLC患者。這些患者腫瘤組織標(biāo)本分為新鮮組織、石蠟組織和胸水組織，主要來源于手術(shù)切除、穿刺活檢以及胸水脫落細(xì)胞。

1.2 方法 新鮮及胸水標(biāo)本先加入裂解液，從400 μL裂解液中用試劑盒（Qia-gen, Hilden, Germany）提取DNA，再用50 μL的蒸餾水洗脫，最后將提取好的DNA放入-20oC冰箱保存?zhèn)溆?。提供的石蠟組織，切10張-15張白片，同時(shí)染1張HE切片，并在HE切片上標(biāo)記腫瘤組織區(qū)，將白片用無水乙醇浸泡后，對(duì)照HE切片刮取收集腫瘤組織，加入裂解液，從400 μL裂解液中用試劑盒（Qia-gen, Hilden, Germany）提取DNA，再用50 μL的蒸餾水洗脫，最后將提取好的DNA放入-20oC冰箱保存?zhèn)溆?。通過聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）將EGFR基因中18-21外顯子用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。最終的擴(kuò)展分別用直接測(cè)序法和ARMS法來比較兩者的測(cè)試結(jié)果。對(duì)于兩個(gè)方法測(cè)試結(jié)果不一致的，先進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)后仍不一致者采用ADX-EGFR試劑盒重新測(cè)試。

直接測(cè)序法是將提取的產(chǎn)物與特異性引物用ABI PRISM 3730 DNA分析器進(jìn)行分析測(cè)序（應(yīng)用生物系統(tǒng)，CA，USA）。ARMS法是將患者的DNA用ADx-EGFR突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，該試劑盒利用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）的原理，涵蓋了EGFR基因中18-21外顯子的29個(gè)突變點(diǎn)，包括3種18外顯子突變，19種19外顯子突變，5種20外顯子突變和2種21外顯子突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者和樣本特征 自2012年4月-2013年6月本中心接受進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)的患者共451例，分別用直接測(cè)序法和ARMS法檢測(cè)。這些患者包括204例男性，247例女性，平均年齡54.8歲±9.5歲，年齡跨度32歲-88歲。新鮮組織包括手術(shù)切除、纖維支氣管鏡活檢、肺及淋巴結(jié)穿刺的新鮮標(biāo)本；石蠟組織包括除了胸水之外的病理標(biāo)本經(jīng)過處理后的標(biāo)準(zhǔn)FFPE標(biāo)本；胸水為胸水脫落細(xì)胞。有腫瘤組織學(xué)分型的患者有406例，其中鱗癌57例，腺癌329例，其他20例。

2.2 直接測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果 451例患者使用直接測(cè)序法檢測(cè)，其中有182例檢測(cè)到EGFR基因突變，突變率為40.4%（182/451）；單突變178例，包括18外顯子7例，占所有突變的3.9%（7/178）；19外顯子99例，占所有突變的55.6%（99/178）；20外顯子4例，占所有突變的2.3%（4/178）；21外顯子68例，占所有突變的38.2%（68/178），主要是L858R點(diǎn)突變。另外檢測(cè)到雙突變2例，1例為G724S+L858R；1例為S768I+L858R。三突變2例，分別為L730F+S768I+21外顯子點(diǎn)突變；19外顯子插入突變+S768I+L858R。

圖 1 直接測(cè)序法檢測(cè)21外顯子L858R點(diǎn)突變Fig 1 Exon 21 L858R point mutation by direct sequencing

圖 2 直接測(cè)序法檢測(cè)19外顯子缺失突變Fig 2 Exon 19 eletion mutation by direct sequencing

2.3 ARMS法檢測(cè)結(jié)果 451例患者使用ARMS法檢測(cè)，其中有215例EGFR基因突變，突變率為47.7%（215/451），單突變212例，其中18外顯子4例，占所有突變的1.9%（4/212）；19外顯子突變117例，占所有突變的55.2%（117/212），主要是缺失突變；20外顯子1例，占所有突變的0.5%（1/212）；21外顯子90例，占所有突變的42.4%（90/212），主要是L858R點(diǎn)突變。另外檢測(cè)到雙突變3例，為S768I+L858R雙突變。

2.4 直接測(cè)序法和ARMS法檢測(cè)結(jié)果比較 在該451例兩種方法均檢測(cè)的患者中，兩種方法均檢測(cè)到突變且突變結(jié)果一致者127例，結(jié)果不一致者5例，均無突變者186例，直接測(cè)序法檢測(cè)到突變而ARMS法未檢測(cè)到突變者50例，反之83例。50例中有33例為ARMS法29種突變之外的突變。根據(jù)表3所示，直接測(cè)序法和ARMS法的診斷符合率為70.51%（318/451）。

2.5 不同組織來源檢測(cè)結(jié)果 在該451例患者中，新鮮組織240例，石蠟組織204例，胸水7例。240例新鮮組織中，直接測(cè)序法檢測(cè)到突變者95例，突變率為39.58%（95/240），A R M S法檢測(cè)到突變者為9 2例，突變率為38.33%（92/240）；兩種方法突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.083）。在204例石蠟組織標(biāo)本中，直接測(cè)序法檢測(cè)到突變者85例，突變率為41.67%（85/204），ARMS法檢測(cè)到突變者為122例，突變率為59.80%（122/204）；兩種方法突變率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。在7例胸水組織中，直接測(cè)序法檢測(cè)到突變者2例，突變率為28.57%（2/7），ARMS法檢測(cè)到突變者為1例，突變率為14.29%（1/7）；但由于胸水組織標(biāo)本量過少，不具代表性，在此不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 討論

在NSCLC的治療中，分子靶向藥物TKIs的應(yīng)用開啟了肺癌治療的新道路，現(xiàn)可作為一線治療。TKIs療效好，針對(duì)性強(qiáng)，副作用小，但價(jià)格昂貴，對(duì)于該藥敏感性的檢測(cè)就是決定是否可以用藥的關(guān)鍵。目前公認(rèn)最有效的預(yù)測(cè)TKIs療效的生物標(biāo)志為EGFR激酶區(qū)的突變，EGFR突變與TKIs對(duì)于NSCLC患者的治療效果是緊密聯(lián)系在一起的，因此臨床上需要一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)EGFR突變的方法。

表 1 直接測(cè)序法檢測(cè)出的33例ARMS試劑盒不包括的突變Tab 1 33 mutations by direct sequencing that ARMS kit not include

直接測(cè)序法應(yīng)用PCR直接擴(kuò)增EGFR基因第18-21外顯子的基因片段，目前普遍認(rèn)為是EGFR基因突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但其過程比較繁瑣，耗時(shí)長；對(duì)標(biāo)本所含腫瘤組織的要求比較高，敏感性不低于30%突變拷貝數(shù)[19]。測(cè)序峰中是否出現(xiàn)了突變波決定了PCR結(jié)果的判斷，因此，突變波波峰的高低影響判斷的結(jié)果。在本研究中，對(duì)于直接測(cè)序法269例未檢出突變的患者中，ARMS法多檢測(cè)出了50例，主要為21外顯子突變，該研究表明在直接測(cè)序法中，21外顯子較其他外顯子更易漏檢。

表 2 兩種方法檢測(cè)的不一致的突變Tab 2 Inconsistent mutations by the two methods

表 3 直接測(cè)序法和ARMS法檢測(cè)結(jié)果比較Tab 3 The comparison between direct suquencing and ARMS

ARMS法是利用Taq DNA聚合酶針對(duì)不同的已知突變，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊镆詸z測(cè)出突變基因。擴(kuò)增產(chǎn)物通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行分析。與直接測(cè)序法相比，ARMS法敏感度高，為1%[20]，檢測(cè)起來方便快捷。但ARMS法僅適用于單個(gè)已知基因的突變，且由于儀器昂貴限制了臨床應(yīng)用。Kimura等[21]和Horiike等[22]先后報(bào)道了ARMS法的高度特異性和靈敏度，但他們僅僅檢測(cè)了兩個(gè)最常見的突變位點(diǎn)——第19外顯子DelE746-A750和第21外顯子L858R，所檢測(cè)的其他突變類型也較局限，且可能出現(xiàn)漏檢。在本研究中，通過直接測(cè)序法檢測(cè)出來ARMS試劑盒29種突變之外的突變?yōu)?3例，表明ARMS法僅可檢測(cè)出常見突變，也可能出現(xiàn)漏檢。但是對(duì)于29種突變之外的突變，是否對(duì)TKIs有一定的療效，還有待進(jìn)一步的研究。

從不同腫瘤組織的樣本取材來看，不同組織對(duì)于EGFR突變檢測(cè)的結(jié)果也有一定的影響。許多有關(guān)直接測(cè)序法和ARMS法檢測(cè)EGFR基因突變的研究都已表明ARMS法比直接測(cè)序法具有更高的特異性和靈敏度。趙婧雅等[23]的研究表明，對(duì)于活檢小標(biāo)本而言，ARMS法較直接測(cè)序法擁有更高的突變檢出率；而對(duì)于手術(shù)標(biāo)本無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在本研究中，新鮮組織中含有較多的腫瘤組織，因此兩者比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而對(duì)于腫瘤組織較少的樣本，需要較高敏感度，ARMS法則明顯優(yōu)于直接測(cè)序法。而對(duì)于胸水組織樣本的比較以往也有研究，但本例樣本量少，不予討論。因此，可以根據(jù)不同組織來源的樣本，選擇合適的檢測(cè)方法，從特異性、敏感性、經(jīng)濟(jì)快捷各方面取得最優(yōu)方案。

本研究中也有很多不足之處，在該451例患者中，胸水組織樣本過少，不具代表性，不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，本研究中的ARMS法敏感性較其他研究文獻(xiàn)中偏低，原因可能是有相當(dāng)比例的標(biāo)本是新鮮組織，標(biāo)本的一部分用直接測(cè)序法檢測(cè)，一部分用ARMS法檢測(cè)，檢測(cè)前并不能確定其中是否含有腫瘤組織，這也就導(dǎo)致兩種方法檢測(cè)的不一致。較理想的做法是經(jīng)病理確認(rèn)，同一份DNA分成二份來分別檢測(cè)。最后，檢測(cè)的目的是指導(dǎo)靶向藥物的治療，但由于經(jīng)濟(jì)等綜合原因，只有少數(shù)患者在本中心選擇靶向治療，其數(shù)據(jù)和結(jié)果也不具備一定的代表性，在此也未予討論。

直接測(cè)序法和ARMS法檢測(cè)EGFR基因突變基本一致，ARMS法更為靈敏，且操作方便快捷，但是價(jià)格昂貴；對(duì)于腫瘤組織含量較少的樣本中，ARMS法更為敏感，明顯優(yōu)于直接測(cè)序法；直接測(cè)序法可以檢測(cè)到ARMS試劑盒內(nèi)不包含的少見突變，結(jié)合兩種方法檢測(cè)結(jié)果更為可靠全面。