劉軍 承解靜 楊曉燕 楊潔 王麗敏 孫燕妮

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院急診內(nèi)科，上海 200062)

近10年內(nèi)，發(fā)達(dá)國家的膿毒癥發(fā)病率以每年8%～13%的速度劇增，重癥膿毒癥的病死率仍高達(dá)28%～50%[1]。祖國醫(yī)學(xué)將膿毒癥歸為“外感熱病”范疇, 針對(duì)其病因病機(jī)提出“菌毒并治”的中西醫(yī)結(jié)合治療原則，總結(jié)了膿毒癥治療的“三證三法”，一定程度上降低了膿毒癥的病死率，顯示了中西醫(yī)結(jié)合治療在防治膿毒癥中的優(yōu)勢[2]。本研究旨在探討大黃牡丹湯含藥血清對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)中Toll白介素受體相關(guān)調(diào)節(jié)因子(Toll-interleukin 1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-b，TRIF)及TRIF相關(guān)的接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 大黃牡丹湯：大黃12 g、牡丹3 g、桃仁9 g、冬瓜仁30 g、芒硝9 g，水煎3次，每次水煎時(shí)間分別為1.5 h、1 h和45 min，合并煎煮液后過濾并濃縮至高(含生藥1.6 g/mL)、中(含生藥0.8 g/mL)、低(含生藥0.4 g/mL)濃度，置冰箱4 ℃保存。以上中藥均由我院中藥房及制劑科提供。LPS購自美國Sigma公司，TRIF和TRAM多克隆抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG購自美國Santa Cruz公司，Trizol和RT-PCR試劑盒均購自日本寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 雄性SD大鼠20只, 體質(zhì)量(250+20)g,由上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后備用。小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清的制備 20只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組以及中藥高、中、低濃度組，每組5只。每日上午9∶00對(duì)中藥高、中、低濃度組分別以高(13.2 g/kg)、中(6.6 g/kg)、低(3.3 g/kg)濃度大黃牡丹湯灌胃。正常組以等量的0.9%氯化鈉液灌胃。連續(xù)7 d，末次灌胃(灌藥前12 h禁食但不禁水)給藥2 h后心臟采血并處死，離心后分離血清。合并同組含藥血清，56 ℃水浴30 min，用0.22 μm微孔濾膜除菌過濾后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種至6孔板中，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，待細(xì)胞生長融合為單層后，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖冼后分為5組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組：加入含10%無藥物血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL；模型組：加入含10%無藥物血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL和LPS(5 μg/mL)；中藥低濃度組加入含10%低濃度藥物血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL和LPS(5 μg/mL)；中藥中濃度組：加入含10%中濃度藥物血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL和LPS(5 μg/mL)；中藥高濃度組：加入含10%高濃度藥物血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL和LPS(5 μg/mL)；各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別收集細(xì)胞及上清液。

1.3.3 RT-PCR法檢測細(xì)胞中TRIF和TRAM的mRNA表達(dá) 所有基因序列均從GenBank中獲取，引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，見表1。采用Trizol法提取小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，35個(gè)循環(huán)，以GADPH為內(nèi)參照，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物并拍照，采用Flour-S成像儀分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值分析。

表1 RT-PCR檢測引物序列

1.3.4 Western blotting檢測細(xì)胞中TRIF和TRAM蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)24 h后，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白樣品，采用BCA法檢測蛋白濃度，將制備好的蛋白樣品置于-70℃保存?zhèn)溆?，行SDS-PAGE電泳分離條帶，轉(zhuǎn)膜，封閉，TBST(Tris-buffered saline with Tween)洗膜，加入TRIF和TRAM的多克隆抗體(稀釋比1∶500)，4 ℃反應(yīng)過夜，洗滌,加入二抗并室溫下孵育1～2 h，洗滌，X線膠片曝光，圖片掃描，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的灰度值，以TRIF/TRAM蛋白條帶與β-actin條帶密度積分的比值表示TRIF/TRAM蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1 不同中藥濃度對(duì)LPS處理后細(xì)胞中TRIF和TRAM的mRNA表達(dá)水平的影響 模型組TRIF和TRAM的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，中藥中、高濃度組的TRIF和TRAM的mRNA表達(dá)水平均顯著低于中藥低濃度組及模型組(P<0.01)，而中藥中、高濃度組之間TRIF和TRAM的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低濃度組與模型組之間TRIF和TRAM的mRNA表達(dá)水平差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2 、圖1。

表2 各組細(xì)胞中TRIF和TRAM的mRNA表達(dá)水平

M: 分子量標(biāo)志物; 1: 對(duì)照組; 2: 模型組; 3: 中藥低濃度組; 4: 中藥中濃度組; 5: 中藥高濃度組

2.2 不同中藥濃度對(duì)LPS處理后細(xì)胞中TRIF和TRAM的蛋白表達(dá)水平的影響 模型組TRIF和TRAM的蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(均P<0.01)，中藥中、高濃度組TRIF和TRAM的蛋白表達(dá)水平均顯著低于低濃度組(P<0.05)及模型組(P<0.01)，而中藥中、高濃度組之間TRIF和TRAM的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低濃度組與模型組之間TRIF和TRAM的蛋白表達(dá)水平差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3、圖2。

表3 各組細(xì)胞中TRIF和TRAM的蛋白表達(dá)水平

1: 對(duì)照組; 2: 模型組; 3: 中藥低濃度組; 4: 中藥中濃度組; 5: 中藥高濃度組

3 討 論

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)廣泛表達(dá)于天然免疫系統(tǒng)，因其胞外區(qū)與一種果蠅蛋白Toll同源而得名。TLR是一類跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成，其胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)結(jié)構(gòu)域，而胞內(nèi)則稱為Toll樣白介素-1受體區(qū)(Toll-interleukin 1 receptor, TIR)結(jié)構(gòu)域。Toll樣受體家族包括細(xì)胞表面TLR(TLR4/MD2、TLR1、TLR2、TLR6等)和細(xì)胞內(nèi)TLR(TLR3、TLR7、TLR8、TLR9等)[3]。

TLR配體大體上可分為內(nèi)源和外源兩大類，不同的TLR識(shí)別結(jié)合不同的配體。作為模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，TLR4在天然免疫中發(fā)揮重要作用[4]。當(dāng)細(xì)菌入血并崩解釋放內(nèi)毒素后，其主要成分細(xì)胞壁LPS與LPS結(jié)合蛋白(LPS-binding rotein，LBP)結(jié)合，通過CD14傳遞給TLR4/髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2，MD2)復(fù)合體，形成異源二聚體，通過2種不同的接頭蛋白啟動(dòng)兩條信號(hào)通路： TIRAP-MyD88通路(MyD88依賴性途徑)及TRIF-TRAM通路(非MyD88依賴性途徑)。

非MyD88依賴性TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要是通過TRIF進(jìn)行傳遞的。人TRIF基因位于染色體19p13.3，與TLR3和TLR4誘導(dǎo)干擾素、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10、干擾素調(diào)節(jié)基因-1的表達(dá)有關(guān)[5]。含有TIR功能域的TIR接頭蛋白(TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP)和TRAM參與了非MyD88依賴性TLR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TIRAP是TLR2和TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的接頭蛋白；TRAM主要參與TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。

膿毒癥主要由革蘭陰性桿菌所致[7]。LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分，是TLR4的特異性激動(dòng)劑，而對(duì)其他TLR無激動(dòng)作用；TLR4 基因缺失或突變可以導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)性嚴(yán)重缺失[8]。本研究應(yīng)用純化LPS作為TLR4激動(dòng)劑，刺激RAW 264.7，并采用不同劑量大黃牡丹湯含藥血清進(jìn)行干預(yù)，研究大黃牡丹湯含藥血清對(duì)非MyD88依賴性通路的影響。

大黃牡丹湯出自《金匱要略》，全方集瀉下、清熱、破瘀于一體，近年來已廣泛用于治療急性闌尾炎、急性膽囊炎，急性胰腺炎，腹膜炎、急慢性盆腔炎等多種炎性疾病。臨床試驗(yàn)[9]表明，大黃牡丹湯能明顯降低急腹癥患者外周血中內(nèi)毒素含量，抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞過度分泌白細(xì)胞介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。

本課題組的以往研究采用盲腸末端結(jié)扎穿孔法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，用大黃牡丹湯進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)大黃牡丹湯可以抑制膿毒癥肺損傷大鼠血清及肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的表達(dá)，下調(diào)促炎介質(zhì)TNF-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)，上調(diào)抗炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-10(IL-10)的表達(dá)，促進(jìn)免疫平衡，同時(shí)還能夠抑制肺組織髓過氧化物酶活性，減輕肺組織的病理改變。

本研究的目的是探討不同濃度大黃牡丹湯含藥血清對(duì)TLR4非MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。造模后RAW 264.7細(xì)胞中TRIF、TRAM的mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，中、高濃度大黃牡丹湯含藥血清組TRIF和TRAM的表達(dá)顯著低于模型組(P<0.01)，中、高濃度兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。 結(jié)果提示，中、高濃度大黃牡丹湯能夠抑制膿毒癥非MyD88依賴性通路中TRIF和TRAM的表達(dá)，這可能是大黃牡丹湯治療膿毒癥的機(jī)制之一。

綜上所述，大黃牡丹湯可以從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄水平干預(yù)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和損傷效應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)膿毒癥的治療作用；除了抑制非MyD88依賴性通路中TRIF和TRAM的轉(zhuǎn)錄表達(dá)外，是否還有其他機(jī)制，則有待今后進(jìn)一步研究。

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