石海峰 強(qiáng)金偉 李若坤

(1.江蘇省常州市第二人民醫(yī)院影像科，江蘇常州 213003；2.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院影像科，上海 201508)

小腸是所有腹部臟器中對缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)最為敏感的器官[1]。小腸IRI常見于不轉(zhuǎn)流的腹主動脈瘤手術(shù)、體外循環(huán)、絞窄性疝、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、小腸移植，也可見于感染性休克和低血容量性休克[2]。小腸微循環(huán)障礙是引發(fā)和加重小腸IRI的關(guān)鍵性因素，而且微循環(huán)功能障礙往往發(fā)生于組織細(xì)胞損傷之前[3]。血液濃縮、血栓形成、白細(xì)胞堵塞毛細(xì)血管、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、血管舒縮功能障礙和與水腫相關(guān)的組織間隙壓力增加等病理生理機(jī)制是導(dǎo)致再灌注失敗的原因。小腸IRI可造成腸黏膜屏障功能障礙，引起腸道菌群移位和內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)失控性釋放，誘發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征，造成心、肺、肝、腎等遠(yuǎn)隔器官損傷[4]，引起多器官功能障礙綜合征和多器官衰竭[5]。所以早期評價小腸IRI微循環(huán)變化有著重要的臨床意義。CT和超聲曾被用來評價小腸IRI發(fā)生時腸道的形態(tài)學(xué)改變[6]，但這些方法準(zhǔn)確率低和敏感性差。丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是反映組織IRI重要的生化指標(biāo)[7]，多層螺旋CT(multi-slice CT，MSCT)灌注成像具有安全、無創(chuàng)、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，可從毛細(xì)血管水平評價組織灌注，與組織代謝關(guān)系更密切[8]。本研究旨在探討應(yīng)用MSCT灌注成像技術(shù)評價小腸IRI腸道血流動力學(xué)變化的價值，同時研究灌注參數(shù)與反映IRI的臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 48只巴馬豬，體質(zhì)量(23.8±4.6)kg，雌雄不限，130～150日齡(購自上海農(nóng)科院養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK 滬 2010-0025)。術(shù)前禁食24 h，自由飲水。將24只巴馬豬隨機(jī)分為缺血2 h后再灌注1 h、2 h、3 h、4 h IRI組，每組6只；每組分別設(shè)立相應(yīng)時間點(diǎn)(術(shù)后3 h、4 h、5 h、6 h)的假手術(shù)組(sham組)，每組5只。另外，設(shè)立單純?nèi)毖M(缺血2 h)作為病理對照，共4只。

1.2 IRI模型制作 巴馬豬大腿后上部肌內(nèi)注射氯胺酮10 mg/kg，阿托品0.02 mg/kg，開放耳緣靜脈，連接多功能監(jiān)護(hù)儀，氣管插管接麻醉機(jī)行機(jī)械通氣。持續(xù)吸入七氟醚維持麻醉。術(shù)中滴注晶體液，滴注速度為10 mg/(kg·h)，持續(xù)監(jiān)測動物食道體溫，并用可調(diào)式電熱毯進(jìn)行保溫，以維持動物正常體溫在38～39 ℃。麻醉平穩(wěn)后，使豬取平臥位，采用腹部正中切口，分離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)主干及其主要分支，用無損傷動脈夾夾閉SMA 2 h后松開動脈夾進(jìn)行再灌注。Sham組僅打開腹腔，分離SMA，不做夾閉處理。單純?nèi)毖M，夾閉SMA 2 h后立即處死巴馬豬，手術(shù)過程約20 min，出血量10～20 mL，術(shù)中豬的生命體征平穩(wěn)。

1.3 MSCT灌注成像掃描 掃描前豬腹部綁腹帶以減輕呼吸運(yùn)動幅度。采用Somatom Definition AS 128層螺旋CT(德國Siemens公司)進(jìn)行動態(tài)增強(qiáng)灌注掃描，先行平掃，掃描范圍為膈頂至恥骨聯(lián)合。重建層厚5 mm，層間距5 mm，螺距為1，然后選定中下腹部顯示小腸最大范圍層面作為灌注掃描層面，選擇Abdomen VPCT Long掃描模式，覆蓋范圍16.8 mm，層厚3.0 mm，管電壓80 kV，管電流110 mA。增強(qiáng)對比劑選用碘普羅胺(370 mgI/mL，德國拜耳先靈藥業(yè)公司)，采用高壓注射器(Medrad，美國PA公司)自動注射，注射速率為5 mL/s，對比劑量50 mL，注射結(jié)束后追加0.9%氯化鈉液40 mL。注射后延遲5 s開始掃描，連續(xù)動態(tài)掃描23次，間隔時間為3.50 s，掃描時間共54.08 s。

1.4 灌注圖像分析 將掃描重建后圖像導(dǎo)入影像診斷工作站(Syngo，德國Siemens公司)，采用灌注軟件VPCT Body對數(shù)據(jù)進(jìn)行灌注成像分析。對圖像進(jìn)行運(yùn)動校正，通過灌注軟件計算獲得小腸CT灌注圖像以及血容量(blood volume，BV)、血流量(blood flow，BF)、平均通過時間(mean transit time，MTT)和表面通透性(permeability surface，PS)等小腸灌注參數(shù)。

按以下標(biāo)準(zhǔn)來選擇感興趣區(qū)(region of interests，ROI)：(1)選擇盡可能小的ROI，圖像進(jìn)行放大2倍左右以便于選取ROI時盡量避開腸腔內(nèi)氣液體和脂肪；(2)選擇受呼吸運(yùn)動及腸管蠕動影像較小的層面，在BF或BV灌注圖上進(jìn)行腸壁ROI的選取，并以最大密度投影(maximum intensity projection，MIP)圖像進(jìn)行對照以確保ROI準(zhǔn)確定位于腸壁。對回腸不同部位重復(fù)測量6次取平均值，得到MSCT灌注參數(shù)值。

1.5 病理觀察及檢測指標(biāo) 所有巴馬豬在實驗結(jié)束時靜脈注射10%氯化鉀20 mL處死，取一段3 cm左右遠(yuǎn)端回腸(距回盲瓣10 cm)用10%甲醛固定24 h。然后，常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色，光鏡下觀察。采用Chiu[9]等的評分標(biāo)準(zhǔn)評價小腸黏膜損傷情況。另取一段長約20 cm的遠(yuǎn)端回腸，用0.9%氯化鈉液洗凈腸腔內(nèi)容物，用玻片刮取約100 mg的腸黏膜組織，放入液氮瓶內(nèi)進(jìn)行速凍，隨后將標(biāo)本放入-80 ℃冰箱保存，送江蘇南京建成生物公司檢測黏膜內(nèi)SOD活性和MDA含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較IRI組4個時間點(diǎn)的腸道灌注參數(shù)以及實驗室生化指標(biāo)，方差齊時采用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)對各組灌注參數(shù)進(jìn)行兩兩比較，而方差不齊時采用Tamhane對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較。運(yùn)用Spearman相關(guān)性分析，檢驗BV、BF與MDA、SOD的相關(guān)性。IRI組與sham組灌注參數(shù)的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

IRI組2只巴馬豬分別在再灌注1.5 h和3.6 h時死亡，因此不用于實驗數(shù)據(jù)分析。sham組和單純?nèi)毖M中無死亡。

2.1 IRI組各時間點(diǎn)小腸灌注參數(shù)參數(shù)比較 隨著再灌注時間的延長，IRI組BF、BV、PS呈整體下降的趨勢，其中BF、BV在再灌注3 h時間點(diǎn)有輕度一過性上升(相對于再灌注2 h時間點(diǎn))，再灌注1 h時間點(diǎn)BF與其他各時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；再灌注1 h時間點(diǎn)BV僅與再灌注4 h時間點(diǎn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各時間點(diǎn)MTT差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；再灌注1 h時間點(diǎn)PS與再灌注3 h、4 h時間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，再灌注2 h和4 h時間點(diǎn)PS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 IRI組與sham組灌注參數(shù)比較以及 IRI組各時間點(diǎn)灌注參數(shù)結(jié)果比較

2.2 IRI組與sham組各時間點(diǎn)灌注參數(shù)比較 sham組各時間點(diǎn)灌注參數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。IRI組BF在再灌注4 h與sham組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IRI組BV在再灌注2 h、3 h、4 h時與sham組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；IRI組MTT在各時間點(diǎn)與sham組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01和0.05)；IRI組PS在再灌注3 h和4 h時與sham組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.3 小腸黏膜生化指標(biāo)比較 IRI組各時間點(diǎn)小腸黏膜生化指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，MDA除在再灌注3 h時稍有下降外，隨著再灌注時間的延長整體呈上升趨勢，SOD變化則與之相反。在再灌注4 h時的MDA和SOD值，IRI組與sham組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。BF、BV與MDA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.714、-0.713，P<0.01)，BF、BV與SOD呈正相關(guān)(r=0.641、0.677，P<0.01)，見圖2。

圖1 IRI組、sham組4個時間點(diǎn)腸黏膜的MDA含量和SOD活性。IRI組中隨著再灌注時間延長，MDA含量呈增加趨勢，SOD含量呈下降趨勢；但在再灌注3 h，MDA和SOD含量有一定程度恢復(fù)

2.4 小腸黏膜病理觀察 IRI組可見小腸黏膜上皮有不同程度的脫落，可見裸露的固有層，黏膜內(nèi)有數(shù)量不等的中性粒細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，見圖3。sham組則腸黏膜、黏膜下層結(jié)構(gòu)完整，腸壁內(nèi)未見炎性細(xì)胞，見圖4。IRI組再灌注1 h、2 h、3 h、4 h小腸黏膜損傷評分分別為(3.2±1.2)、(3.7±1.1)、(3.5±1.2)、(3.6±1.2)分，缺血組評分4.0分，IRI各組間及其與缺血組間評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 BF、BV與MDA、SOD相關(guān)散點(diǎn)圖，BF和BV與MDA呈負(fù)相關(guān)，BF、BV與SOD呈正相關(guān)

A：BF；B：BV；C：MTT；D：PS；E：小腸黏膜上皮脫落，間質(zhì)擴(kuò)張充血，黏膜內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤，病理分級4級(HE染色，×100)；F：黏膜內(nèi)大量浸潤的中心粒細(xì)胞，見黃色箭頭(HE染色，×200)

A：BF；B：BV；C：MTT；D：PS，灌注圖顯示小腸血流灌注豐富、大致均勻；E：黏膜、黏膜下層結(jié)構(gòu)完整，腸壁內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤(HE染色，×40)

3 討 論

小腸IRI是一個復(fù)雜的、多因素參與的病理生理過程。其中主要的一個病理生理過程就是產(chǎn)生的活性氧致微循環(huán)損傷。隨著灌注CT掃描可以多層容積灌注以及灌注后處理軟件的進(jìn)一步成熟，特別是運(yùn)動校正功能的運(yùn)用，小腸CT灌注變得可行。Sitek等[10]通過移動修正、動態(tài)增強(qiáng)CT及單室血流動力學(xué)模型初步證實了CT灌注評價小腸血流動力學(xué)的可行性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在小腸發(fā)生IRI時，小腸微循環(huán)呈現(xiàn)低血流變化。隨著再灌注時間的延長，BF除在再灌注3 h時稍有恢復(fù)外，整體呈下降趨勢。IRI主要是以急性炎性反應(yīng)的方式影響毛細(xì)血管后使微循環(huán)損傷，其中白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是損傷的主要原因，隨著炎性細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞的增多，可以導(dǎo)致血管管腔逐漸堵塞，血流速度緩慢[11]，上述機(jī)制是導(dǎo)致BF下降的原因。再灌注期間BV變化的趨勢與BF相仿，BV在再灌注1 h、2 h時下降幅度最大，由于小腸IRI導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管舒張功能障礙以及組織水腫所致的組織間隙壓的增高而致毛細(xì)血管受壓狹窄[3]，以上機(jī)制可能是再灌注期間BV下降的病理生理機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)再灌注各時間點(diǎn)的MTT基本無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但是IRI組MTT低于sham組，在小腸發(fā)生IRI期間，腸壁內(nèi)小血管發(fā)生持續(xù)收縮，導(dǎo)致對比劑在血管內(nèi)停留的時間較短[12]，這可能是IRI組MTT較低的原因，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

生物體內(nèi)SOD活性的高低反映機(jī)體清除自由基的能力，也間接地提示體內(nèi)自由基是否過剩，當(dāng)IRI時，產(chǎn)生的相當(dāng)多的氧自由基致SOD過度消耗。本研究發(fā)現(xiàn)BF、BV與SOD呈正相關(guān)、與MDA呈負(fù)相關(guān)。這說明MSCT灌注的結(jié)果能比較客觀地反映小腸IRI的情況。

本研究發(fā)現(xiàn)缺血2 h再灌注后的回腸黏膜組織損傷并沒有進(jìn)一步加重，甚至病理評分略低于單純?nèi)毖獣r的黏膜損傷。有研究[13]表明，再灌注后腸黏膜損傷會進(jìn)一步加重，該類研究都是用嚙齒類動物來制作小腸IRI模型，我們分析這類動物體內(nèi)的黃嘌呤氧化酶遠(yuǎn)高于豬，這可能是導(dǎo)致本研究與以上研究結(jié)果相反的原因。

本研究的不足：雖然MSCT灌注后處理軟件具有運(yùn)動校正功能，但呼吸運(yùn)動和腸道蠕動造成的偽影對MSCT灌注結(jié)果仍有一定的影響。由于山莨菪堿及胰高血糖素等抑制腸道蠕動藥物對微循環(huán)有保護(hù)作用，所以本研究未加以采用。另外，由于小腸腸壁菲薄，即使是腸襻聚集區(qū)域，在選取ROI時由于腹腔內(nèi)脂肪及腸腔內(nèi)氣體的影響無法完全避免，時間-密度曲線表現(xiàn)雜亂無章，本研究中此問題無法克服。此外，本研究動物數(shù)量較少，更正確的結(jié)果有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，MSCT灌注成像技術(shù)對小腸IRI腸壁微循環(huán)的改變有一定的診斷價值，其中BV、BF與反映IRI的生化指標(biāo)具有很好的相關(guān)性，能敏感地反映小腸IRI微循環(huán)損傷狀況，有望為小腸IRI的診斷提供新的手段。

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