張素青 陳櫞 張一心 劉繼斌 朱燁菁 錢俊 李德春

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，江蘇蘇州 215006；2.江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院普外科，江蘇南通 226361；3.南通大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇南通 226019)

目前認為，癌基因的激活與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)，阻斷癌基因的高表達可以防止正常細胞癌變，甚至可使惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)為正常細胞[1]。YAP(yes-associated protein)是一種癌基因，其通過Hippo通路促進細胞凋亡，進而導(dǎo)致細胞接觸性抑制的喪失，促進細胞癌變[2]。之前，我們的研究認為，抑制YAP的表達可望提高化療藥物治療腫瘤的療效。本研究則利用小片段干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)來抑制YAP基因表達以觀察肝癌細胞株對阿霉素(adriamycin，ADM)的敏感性變化。

1 資料與方法

1.1 細胞株和試劑 肝癌細胞株Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、ADM、四甲基偶氮唑藍(methyl thialzolyl tetrazolium，MTT)及二甲基亞砜、蛋白免疫印跡(Western blotting)試劑盒、標準蛋白均由上海睿智化學(xué)研究有限公司提供。兔抗人YAP一抗購自美國ImmunoWay公司。羊抗兔二抗購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列的設(shè)計 參照文獻[3]采用在線設(shè)計軟件設(shè)計并篩選出了針對YAP基因啟動子區(qū)域的siRNA序列。上游引物：5′-GACGACCAAUAGCUCAGAUTT-3′，下游引物：5′-UCUGAGCUAUUGGUC GUCTT-3′。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及瞬時轉(zhuǎn)染 肝癌細胞株Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下中培養(yǎng)3 d，定期觀察細胞的生長情況，培養(yǎng)3 d時用胰酶消化并傳代。消化Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L細胞后接種于24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合度為70%時，換為無血清培養(yǎng)液，并按脂質(zhì)體Lipofecta-mineTM 2000的說明書將siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株，同時設(shè)立不轉(zhuǎn)染siRNA的空白組、熒光標記組、對照組(NC組)。轉(zhuǎn)染4 h后，換為DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后用于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。48 h后收集轉(zhuǎn)染效率最高的細胞，提取蛋白；采用蛋白免疫印跡(Western blotting)法檢測YAP的表達。

1.2.3 MTT比色法檢測細胞的存活率 按每孔5000個細胞的密度接種于96孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后按脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000的說明書以siRNA瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4 h后加入不同濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μg/mL)的ADM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT液10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加入三聯(lián)溶解液(10%SDS，5%異丁醇，0.01 mol/L HCl)100 μL過夜，測定各孔在波長560 nm/700 nm處的光密度(A)值?？瞻讓φ战M的孔中加入等量DMEM培養(yǎng)液代替ADM/siRNA，每組培養(yǎng)的細胞均重復(fù)3個孔。根據(jù)公式計算細胞的存活率：細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用t檢驗，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對肝癌細胞株生物學(xué)特性的影響 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，4種肝癌細胞均縮小，大小不等，胞質(zhì)凝縮，細胞增殖受到抑制；而對照組細胞無明顯變化。見圖1。

(見轉(zhuǎn)續(xù))

(續(xù)圖1)

左側(cè)為空白對照組，中間為siRNA轉(zhuǎn)染組，右側(cè)為轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下表現(xiàn)

2.2 Western blotting檢測siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的YAP表達水平 用siRNA轉(zhuǎn)染Huh-7、PLC/PRF/5、MHCC 97H、MHCC 97L后與相應(yīng)的對照組(NC組)進行比較，YAP的表達減少。見圖2。

2.3 MTT比色法檢測肝癌細胞的存活率 各肝癌細胞株均以siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4 h后給予ADM。結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染組存活率明顯低于對照組(P<0.05)。見圖3。

1：NC組；2：Huh-7-siRNA組；3：PLC/PRF/5-siRNA組；4：MHCC 97H-siRNA組；5：MHCC 97L-siRNA組

轉(zhuǎn)染siRNA-3的肝癌細胞株即轉(zhuǎn)染組與空白對照組比較，*P<0.05，***P<0.01

3 討 論

一般認為，YAP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。YAP除了通過Hippo通路促進細胞癌變外[4]，還有研究[5]認為，YAP具有轉(zhuǎn)錄激活因子的功能，通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(p73、TEAD等)調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄，從而影響細胞的凋亡、增殖和侵襲等生物學(xué)行為。Overholtzer等[6]研究發(fā)現(xiàn)，正常的乳腺上皮細胞可因YAP高表達而過度增殖，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，體外培養(yǎng)時呈現(xiàn)錨定非依賴性生長

Da等[7]對98例胃癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，YAP表達陽性率為48%，且YAP的表達與凋亡抑制蛋白Survivin表達呈正相關(guān)。Bai等[8]也得出類似結(jié)論。Sudol等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，YAP與肝癌患者的甲胎蛋白水平密切相關(guān)。

化療是中晚期無手術(shù)指征的肝癌患者的主要治療手段。ADM是常用的肝癌化療藥物，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA合成的抑制作用尤為顯著。術(shù)后的肝癌患者通常對ADM的敏感度低，另外，肝癌對ADM等化療藥物的耐藥性一直是個未解決的問題。

本研究針對YAP基因的啟動子區(qū)域設(shè)計并合成siRNA序列，篩選抑制效果較好的siRNA進行實驗。用熒光顯微鏡觀察和Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA后給予ADM處理的肝癌細胞存活率明顯低于未轉(zhuǎn)染siRNA組，表明siRNA抑制YAP表達可增強肝癌細胞株對ADM的敏感性。

綜上所述，本研究證實，siRNA干擾YAP表達后，肝癌細胞株對ADM敏感性增強，這為應(yīng)用YAP抑制劑逆轉(zhuǎn)肝癌的耐藥性提供了依據(jù)。

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