張慧漲 范齊文 楊華 黃紅梅 方強(qiáng)

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心檢驗(yàn)科，上海 201508；3.上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，上海 200433)

目前，結(jié)核病仍是人類面臨的最嚴(yán)重的傳染病之一。近年來(lái)，結(jié)核分枝桿菌多藥耐藥菌株(multidrug resistance，MDR)的增多及合并艾滋病等使結(jié)核病患者的病死率升高[1]。肺結(jié)核患者的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查以及痰涂片查找抗酸桿菌等。痰涂片檢查結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率偏低；結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)一般需4～8周，陽(yáng)性率也較低；常用的血清學(xué)診斷、結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)皮膚試驗(yàn)等輔助診斷方法也有很多不足。結(jié)核分枝桿菌感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB，簡(jiǎn)稱T-SPOT)技術(shù)具有高特異度和靈敏度，已被國(guó)外廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的檢測(cè)[2]。但是，T-SPOT所需血液量較多，且需24 h才能完成。血清抗體檢測(cè)具有快速、簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，一直是結(jié)核病診斷的研究熱點(diǎn)。

本研究誘導(dǎo)Rv0222大量表達(dá)并純化，然后將其與ESAT-6結(jié)合成融合蛋白，以該融合蛋白為抗原采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清，評(píng)價(jià)其在臨床結(jié)核病及HIV合并結(jié)核病的早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年在復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心就診的結(jié)核病患者42例(其中肺結(jié)核15例，肺外結(jié)核27例；男性24例，女性18例)以及HIV合并結(jié)核病患者36例(其中男性33例，女性3例)；選擇2013年在復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院就診的非結(jié)核疾病患者20例(其中乙型肝炎5例、肝硬化4例、肺炎7例、肺氣腫2例、尖銳濕疣2例；男性12例，女性8例)以及健康體檢者28名(其中男性16名，女性12名，根據(jù)臨床檢測(cè)和病史資料，排除心、肝、腎疾病及糖尿病、腫瘤等疾病)，小兒結(jié)核抗體陽(yáng)性者48例(其中單獨(dú)IgG型38例，IgM和/或IgG型10例；年齡3個(gè)月～7歲；男性27名，女性21名)。收集各受試者的血液標(biāo)本。

1.2 試劑與儀器 pMD18-T載體、聚合酶、內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自生物工程(大連)有限公司；His-Tag純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Novagen公司；HRP標(biāo)記羊抗人二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Taq酶、dNTP、Mg2+、緩沖液購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自上海市肺科醫(yī)院；T-SPOT試劑盒購(gòu)自英國(guó)Oxford Immunotec公司；結(jié)核抗體試劑購(gòu)自北京健乃喜生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)二抗稀釋液、顯色液A、顯色液B、終止液購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 Rv0222和早期分泌性靶抗原(early secretory antigenic target,ESAT-6)基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Rv0222/ESAT-6融合蛋白的引物設(shè)計(jì)

1.4 基因克隆和鑒定 以H37Rv染色體DNA為模板分別擴(kuò)增Rv0222和ESAT-6基因片段。Rv0222基因的PCR反應(yīng)條件：94℃ 7 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。Rv0222基因的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒處理后，裝入pMD18-T載體中；將載有Rv0222基因的pMD18-T酶切處理后，再亞克隆到表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Rv0222。以同樣方式克隆ESAT-6基因。ESAT-6基因PCR反應(yīng)條件：94℃ 7 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Rv0222-ESAT-6，挑選重組克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 重組融合蛋白的收集、純化和抗原性鑒定 挑重組菌，于含100 mg/L氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)；再以1∶100接種到1 L的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，至吸光度(A)值為0.6～0.8；加入β-硫代半乳糖苷至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h；超聲破菌后用8 mol/L尿素溶解，流過(guò)瓊脂糖鎳柱，得到高純度的重組蛋白。將純化變性的蛋白置于半透膜中，在4℃低溫磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)中緩慢透析，使變性蛋白完全溶解。留取樣品，用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。純化蛋白全濕轉(zhuǎn)膜，350 mA，45 min。用含5%小牛血清的PBS封閉1 h，與1∶200稀釋的結(jié)核患者血清的一抗反應(yīng)l h，充分洗滌后與1∶10000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人二抗反應(yīng)2 h，四甲基聯(lián)本胺和雙氧水等反應(yīng)顯色。

1.6 ELISA 以Rv0222/ESAT-6融合蛋白包被酶標(biāo)板，采用ELISA檢測(cè)待測(cè)血清。根據(jù)棋盤滴定法選擇包被抗原濃度為4 μg/mL，每孔100 μL包板，4℃過(guò)夜，洗滌后用含1%牛血清白蛋白的PBS封閉1 h。取95 μL樣品稀釋液，加入Rv0222/ESAT-6抗原預(yù)包被板中，取5 μL待檢樣本加入樣品稀釋液中吹打混勻(1∶20稀釋)，37℃孵育1 h，同時(shí)設(shè)空白孔、陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。濃縮洗液以1∶20用蒸餾水稀釋后，加入300 μL/孔，洗板機(jī)洗板5次。于各反應(yīng)孔中，加入用酶標(biāo)二抗稀釋液新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(1∶10000稀釋)100 μL。37℃孵育30 min。濃縮洗液以1∶20用蒸餾水稀釋后，加入300 μL/孔，洗板機(jī)洗板5次。顯色液A、B等體積混合后，于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液100 μL ，室溫避光反應(yīng)2～5 min。于各反應(yīng)孔中加入終止液50 μL終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上于450 nm/630 nm處檢測(cè)各孔OD值，若大于陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)比較結(jié)核患者、非結(jié)核患者和健康對(duì)照者的抗體陽(yáng)性檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 T-SPOT檢測(cè)結(jié)果 42例結(jié)核患者中24例陽(yáng)性，36例HIV合并結(jié)核患者中18例陽(yáng)性，共42例陽(yáng)性。20例非結(jié)核患者與28例健康體檢者均為陰性。

2.2 42例T-SPOT陽(yáng)性患者的ELISA檢測(cè)結(jié)果 42例中，36例的ELISA結(jié)果為陽(yáng)性，6例為陰性。ELISA與T-SPOT比較，總的陽(yáng)性符合率為86%(36/42)，即ELISA的敏感性為86%。

78例結(jié)核與HIV合并結(jié)核患者的T-SPOT陽(yáng)性率54%(42/78)，ELISA陽(yáng)性率46%(36/78)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 36例T-SPOT陰性的結(jié)核患者與HIV合并結(jié)核患者的ELISA檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 36例T-SPOT陰性患者的ELISA檢測(cè)結(jié)果 (n)

ELISA與T-SPOT比較，總的陰性符合率75%(27/36)；36例T-SPOT陰性的患者中9例ELISA陽(yáng)性，占25%(9/36)；其中有2例培養(yǎng)陽(yáng)性而T-SPOT陰性的患者ELISA陽(yáng)性。

2.4 各組的檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)表3。

表3 各組的檢測(cè)結(jié)果比較 (n)

結(jié)核患者：T-SPOT 陽(yáng)性率57%(24/42)，ELISA陽(yáng)性率71%(30/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

HIV合并結(jié)核患者：T-SPOT陽(yáng)性率50%(18/36)，ELISA陽(yáng)性率61%(22/36)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

非結(jié)核患者與健康體檢者的T-SPOT與ELISA結(jié)果均為陰性，表明ELISA的特異性為100%。

2.5 48例小兒結(jié)核抗體陽(yáng)性者的ELISA檢測(cè)結(jié)果 48例小兒結(jié)核抗體陽(yáng)性者中，所有的ELISA結(jié)果均為陰性。

3 討 論

1999年Behr等[3]比較Mtb(H34Rv株)和卡介苗基因組后發(fā)現(xiàn)了16個(gè)缺失區(qū)，RD4區(qū)是其中之一。RD區(qū)被認(rèn)為與Mtb的毒性直接相關(guān)[4]，是導(dǎo)致卡介苗毒性減弱的主要原因，因此，RD區(qū)成為尋找結(jié)核病免疫學(xué)診斷抗原的方向之一。Rv0222是結(jié)核分枝桿菌H37Rv株中RD4位點(diǎn)enoyl-CoA hydratase echA1基因(789bp)編碼的蛋白，含262個(gè)氨基酸，分子量為27 280.2D，等電點(diǎn)為4.78。Rv0222可能是烯酰輔酶A水合酶，參與脂類代謝。編碼Rv0222的基因經(jīng)研究[5-6]證實(shí)不存在于野生型的牛型分枝桿菌和BCG中，故該基因的檢測(cè)對(duì)于排除卡介苗接種者的假陽(yáng)性較為有利，這與本研究中小兒因接種BCG而結(jié)核抗體陽(yáng)性但ELISA結(jié)果均為陰性相符合。ESAT-6基因位于H37Rv菌株中RD1位點(diǎn)，含96個(gè)氨基酸，分子量為6000 D，由于ESAT-6僅在致病性分枝桿菌(如人結(jié)核分枝桿菌、 牛分枝桿菌、 非洲分枝桿菌、薩斯分枝桿菌、 瘰疬分枝桿菌、 蘇爾加分枝桿菌、 微黃分枝桿菌)中表達(dá) ,特異性強(qiáng)；其在所有BCG亞株和非致病分枝桿菌中均不表達(dá)。許多研究表明，ESAT-6蛋白具有良好的抗原刺激性并能被大多數(shù)結(jié)核患者所識(shí)別。

根據(jù)Rv0222與ESAT-6的生物學(xué)特性，預(yù)期以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為抗原診斷結(jié)核分枝桿菌感染，將會(huì)有較高的特異性和敏感性，在結(jié)核病的早期診斷上可能有優(yōu)勢(shì)。Rosenkrands等[5]對(duì)比了Rv0222蛋白與ESAT-6/CFP10融合蛋白(T-SOPT.TB的診斷抗原)對(duì)結(jié)核感染的診斷效果，二者的敏感性分別為94%、75%。本研究中對(duì)于結(jié)核患者，ESAT-6/CFP10融合蛋白和Rv0222/ESAT-6融合蛋白診斷結(jié)核感染的敏感性分別為57%、71%，證實(shí)Rv0222/ESAT-6融合蛋白是血清學(xué)診斷結(jié)核的一個(gè)有前景的抗原靶標(biāo)。Rosenkrands等[5]發(fā)現(xiàn)，Rv0222檢測(cè)HIV陽(yáng)性的結(jié)核感染者的敏感性(43%)高于HIV陰性的結(jié)核感染者(30%)；ESAT-6/CFP10融合蛋白檢測(cè)這兩類人群結(jié)核感染的敏感性分別為10%、42%。本研究中，對(duì)于HIV陽(yáng)性的結(jié)核患者，Rv0222/ESAT-6融合蛋白和ESAT-6/CFP10融合蛋白的相對(duì)檢出率分別為61%、50%，這表明Rv0222/ESAT-6融合蛋白對(duì)于診斷HIV陽(yáng)性者的結(jié)核感染有較高的敏感性。

綜上所述，以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為抗原的ELISA用于診斷結(jié)核感染的靈敏度和特異性均較高，同時(shí)對(duì)于合并HIV感染的結(jié)核診斷也有較高的檢出率。由于ELISA法具有快速、簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊儀器的優(yōu)點(diǎn)，克服了結(jié)核病傳統(tǒng)檢測(cè)方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)、步驟繁瑣、影響因素多、需特殊儀器等缺點(diǎn)。Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為診斷抗原的ELISA檢測(cè)在結(jié)核病的早期檢測(cè)、早期診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

[1]Siddiqi UR, Leano PS, Chagan-Yasutan H,et al. Frequent detection of anti-tubercular-glycolipid-IgG and -IgA antibodies in healthcare workers with latent tuberculosis infection in the Philippines[J]. Clin Dev Immunol, 2012, 2012(5):610707-610716.

[2]Arend SM,Thijsen SFT,Leyten EMS,et al.Comparison of two interferon-γassays and tuberculin skin test for tracing tuberculosis contacts[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,175 (6):618-627.

[3]Behr MA,Wilson MA,Gill WP,et al. Comparative genomies of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J]．Science，1999,284(5419):1520-1523.

[4]Gagneux S,DeRiemer K,Van T, et al.Variable host-pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(8):2869-2873.

[5]Rosenkrands I, Aagaard C, Weldingh K,et al. Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis[J].Tuberculosis (Edinb), 2008, 88(4) :335-343.

[6]王慶,楊華,金瑞良,等. 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白R(shí)v0222的表達(dá)及血清學(xué)鑒定[J].中國(guó)防癆雜志,2012,1(34):36-39.