鐘秋平，林美芳，戴梓茹，李慧林

（廣西欽州學院海洋學院，廣西欽州 535000）

酶解小球藻蛋白制備多肽的工藝研究

鐘秋平，林美芳，戴梓茹，李慧林

（廣西欽州學院海洋學院，廣西欽州 535000）

摘 要：以欽州灣小球藻為原料，通過單因素和正交試驗探討酶解法制備多肽的最佳工藝。實驗結(jié)果表明：酶解小球藻蛋白制備多肽的最佳工藝條件為：pH 6.5，酶解溫度30℃，酶解時間20 min，料液比1∶100 g/mL。此時多肽得率為15.538%±0.2%。

關(guān)鍵詞：小球藻；多肽；酶解

小球藻（Chlorella spp.）是一類普生性單細胞綠藻，屬于綠藻門（Chlorophyta），綠藻綱（Chlorophyceae），綠藻目（Chlorococcales），卵囊藻科（Oocystaceae），小球藻屬（Chlorella pyrenoidosa）[1-2]。通常蛋白質(zhì)含量較高（55%～67%），有較多的糖類（15%～10%），并含有具有生物活性的藻多糖、植物生長因子、（Chlorella Growth Factors，CGF）、糖蛋白、糖脂蛋白、膳食纖維等[3]。利用酶解法制備生物活性肽，不僅可以提高蛋白質(zhì)的溶解性，降低小球藻中的不良腥味等負面影響，而且營養(yǎng)成分缺失少，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的肽具有易消化吸收和一些蛋白質(zhì)無法比擬的物理化學特性，因而酶解法成了微藻功能成分的研究、保健食品的開發(fā)的一個新熱點[4]。山西醫(yī)科大學證實小球藻具有降低動物血鉛和肝鉛蓄積的作用，日本等國的動物和臨床試驗證實小球藻還具有一定的降血壓、防便秘、提高機體免疫力等作用[5]，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，人類攝取蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收。目前已有從大豆、玉米、魚、和其他微藻蛋白的水解物中成功提取具有生理活性的多肽的報道[6]，但對富含蛋白質(zhì)的小球藻加工制備生物活性多肽的工藝相關(guān)的報道還較少。在前期有關(guān)研究的基礎(chǔ)上，本研究以欽州港小球藻為原料，對酶解工藝中的多個影響因素進行研究，優(yōu)化確定小球藻蛋白制備多肽的工藝參數(shù)，這對于充分開發(fā)利用小球藻中的蛋白質(zhì)資源、多肽的生理活性研究以及進一步開發(fā)功能食品具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

欽州灣小球藻（自行分離）、欽州灣海水。

胰蛋白酶，≥2 500 U/mg，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備多肽的工藝流程

小球藻粉→超聲波破碎→加入蛋白酶→滅酶活→冷卻→磷鉬酸沉淀→離心→取上清液→測定多肽的含量

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 標準曲線的繪制

配置不同濃度的牛血清白蛋白溶液（BSA）標準溶液，分別為 0、100、200、300、400、600、800 μg/mL，以生理鹽水做參比，在595 nm波長處，用考馬斯亮藍結(jié)合法測溶液吸光度，并繪制標準曲線[7]。

1.2.2.2 多肽含量測定

多肽含量測定采用磷鉬酸沉淀法[8]：在滅酶后的酶解液中加入2 mL的磷鉬酸溶液，搖勻，離心，取1 mL上清液，用考馬斯亮藍法測定吸光值，對照牛血清蛋白標準曲線算出多肽的質(zhì)量。多肽質(zhì)量分數(shù)/%=多肽質(zhì)量/總蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)×稀釋倍數(shù)×100

1.2.3 單因素試驗

根據(jù)預實驗結(jié)果選擇胰蛋白酶為實驗用酶。稱取一定量藻泥懸浮于10 mL pH 7.0的0.01 mol/L磷酸緩沖液（PBS）中，用超聲波（280 W，時間30 min）破碎的方法破碎小球藻的細胞壁并進行提取，加入胰蛋白酶進行酶解反應一定時間后，加熱滅活酶（100℃，15 min），冷卻后用磷鉬酸沉淀并用離心機在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，用考馬斯亮藍結(jié)合法測定多肽的含量，計算多肽的得率。

1.2.4 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用L9（34）正交試驗的方法，探討溫度、pH、酶解時間和料液比這4個因子對提取多肽含量的影響。因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 The level of form factors

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的繪制

繪制牛血清蛋白標準曲線如圖1，建立回歸線方程 y=0.005 0x，R2=0.999 3。

2.2 單因素試驗

2.2.1 最佳酶解的溫度選擇

分別在 25、30、35、40、45 ℃下進行酶解，實驗結(jié)果如圖2，表明溫度對多肽的得率影響顯著，溫度為30℃時酶解多肽得率最高，為9.23%。酶解溫度太高或者太低都會影響多肽的得率，原因是溫度過高，會引起蛋白酶失活。因此，選擇30℃作為最佳酶解溫度。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

圖2 酶解溫度對多肽得率的影響Fig.2 The effect of enzyme solution temperature on the peptide yield

2.2.2 pH的選擇

分別調(diào)節(jié)磷酸緩沖液（PBS）的 pH 為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 進行實驗，結(jié)果如圖 3。

圖3 pH對多肽得率的影響Fig.3 The effect of pH on the peptide yield

圖3表明pH在6.0～6.5的范圍內(nèi)多肽的得率是增加的，到了6.5時達到最高，pH超過了6.5后，多肽的得率越來越低。因此，選擇6.5為最適pH。

2.2.3 酶解時間的選擇

分別以酶解時間為 20min、30min、60min、120min進行實驗，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解時間對多肽得率的影響Fig.4 The effect of the enzyme solution time on the peptide yield

由圖4可知，酶解時間為30 min的時候多肽的得率最高，為10.57%，且時間增長，多肽的得率呈下降趨勢，原因可能是放置的時間越長，多肽被微生物降解得越多。因此，30 min為最佳酶解時間。

2.2.4 料液比的選擇

用pH 7.0的0.01 mol/L磷酸緩沖液（PBS）配制濃度為40 U/mL的酶液。分別在100 mL酶液中添加0.5、1、2、3、4 g 的藻粉進行實驗，即料液比分別為 0.5∶100、1∶100、2∶100、3∶100，4∶100 g/mL。結(jié)果如圖 5 所示。

圖5 料液比對多肽得率的影響Fig.5 The effect of ratio of material to solvent on the peptide yield

由圖5可知，當料液比在1∶100 g/mL時達到多肽的得率最大，因此，1∶100 g/mL的料液比最合適。

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以 溫度（A）、pH（B）、酶解時間（C）和料液比（D）為因素，進行正交試驗，以優(yōu)化小球藻蛋白制備多肽的工藝。正交試驗結(jié)果如表2。

表2 最優(yōu)水解條件的正交試驗結(jié)果Table 2 The optimal conditions of orthogonal experimental results

通過正交試驗優(yōu)化，對表2結(jié)果進行極差分析表明，4個因素中對小球藻蛋白制備多肽影響順序為：C＞A＞B＞D，溫度和pH對多肽得率的影響最大，時間、料液比的影響較小。最優(yōu)提取工藝為A2B3C1D2，即小球藻蛋白制備多肽的最佳實驗條件是：pH6.5，溫度30℃，時間20 min，料液比1∶100 g/mL，這與單因素實驗結(jié)果并不完全一致，可能是因為各影響因素之間的相互影響所致。此時多肽最高得率為15.41%。

為了驗證正交實驗的結(jié)果，在得出的最佳實驗方案的基礎(chǔ)上，重復實驗，以驗證試驗結(jié)果的正確性。實驗結(jié)果表明在pH6.5，溫度30℃，時間20 min，料液比1∶100 g/mL 的條件下，多肽得率為（15.538±0.2）%。

3 結(jié)論

本實驗通過酶解欽州灣小球藻制備多肽，通過正交實驗對pH值、酶解溫度、酶解時間和料液比這四個因子進行優(yōu)化，得到最佳工藝條件。實驗證明，酶解法對欽州灣小球藻制備多肽具有很好的促進作用。其最佳的工藝條件為：pH6.5，酶解溫度30℃，酶解時間20 min，料液比1∶100 g/mL。在此條件下進行驗證實驗，多肽得率為（15.538±0.2）%，優(yōu)于正交試驗所得的結(jié)果。因此，正交試驗的結(jié)果可靠。

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Study on Enzymatic Preparation of Polypeptides from Chlorella Protein

ZHONG Qiu-ping，LIN Mei-fang，DAI Zi-ru，LI Hui-lin
（Department of Marine Science，Qinzhou University，Qinzhou 535000，Guangxi，China）

Abstract：In this study， using single factor and orthogonal experiments， the prepare process optimization of polypeptides from chlorella protein of Qinzhou Bay were investigated by enzyme hydrolysis.The results showed that optimum conditions for prepare polypeptides were as follows：pH is 6.5，the hydrolysis temperature and time is 30℃and 20 min，chlorella was mixed with phosphate buffer at ratio of 1∶100 g/mL.At the condition，yield of polypeptides is 15.538%±0.2%.

Key words：chlorella； polypeptide； enzymolysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.015

廣西自然科學基金項目（2010GXNSFA013063）

鐘秋平（1964—），男（漢），副教授，本科，從事海洋生物資源開發(fā)與綜合利用研究。

2013－11－10