徐文秀，王鵬，王曉燕

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000）

正交法優(yōu)化花椒籽黑色素提取工藝研究

徐文秀，王鵬，王曉燕

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000）

摘 要：為了提高花椒籽的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，充分利用花椒資源，以運(yùn)城花椒籽為原料，采用溶液浸提法提取花椒籽中黑色素。以提取液吸光度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察提取過(guò)程中各因素對(duì)花椒籽黑色素得率影響。然后，用正交法優(yōu)化花椒籽黑色素的提取工藝條件。結(jié)果表明：影響花椒籽黑色素得率主次因素為：提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間；正交法最優(yōu)工藝參數(shù)：提取溫度60℃，提取時(shí)間4.5 h，料液比1∶35（g/mL），提取次數(shù)1次，花椒籽黑色素提取液的吸光度達(dá)到最高值0.345。

關(guān)鍵詞：花椒籽；黑色素；提??；正交

花椒（ZanthoxylumL bungeanum Maxim）別名又叫香椒、大花青椒、山椒，屬被子植物門(mén)（Magnoliophydta）雙子葉植物綱（Magnoliopsida），無(wú)患子目（Sapindales）蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）山花椒種（Zanthoxylum schinifolium）?；ń吩谖覈?guó)有非常悠久的栽培歷史，是我國(guó)傳統(tǒng)的“八大調(diào)味料”之一。花椒在我國(guó)主要產(chǎn)區(qū)為陜西（韓城）、四川、重慶、山東、山西、河南、河北等地[1]。據(jù)報(bào)道，2009年全國(guó)花椒栽培面積已達(dá)133．3萬(wàn)hm2，年產(chǎn)花椒100萬(wàn)t，花椒籽作為主要副產(chǎn)物，理論上比果皮超出20%左右，因此花椒籽年產(chǎn)約60萬(wàn)t[2]。山西運(yùn)城巿有很多丘陵地區(qū)，這些地區(qū)很適合花椒種植。每年大量花椒上巿后，作為副產(chǎn)物的花椒籽，卻長(zhǎng)期以來(lái)未被充分利用。大量的花椒籽被廉價(jià)收購(gòu)，或當(dāng)作燃料燒掉或撒入田中作為肥料，甚至被當(dāng)作廢物丟棄，造成極大的資源浪費(fèi)。如何利用花椒籽這一資源已迫在眉睫。綜合開(kāi)發(fā)利用花椒籽既可以解決資源浪費(fèi)、環(huán)境污染的問(wèn)題，還可以帶動(dòng)大批的當(dāng)?shù)亟忿r(nóng)致富。因此，加快花椒籽的研究開(kāi)發(fā)是一個(gè)具有現(xiàn)實(shí)和長(zhǎng)遠(yuǎn)意義。

研究結(jié)果[3]表明：花椒籽的種皮富含天然黑色素。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，天然黑色素具有抗癌、抑制艾滋病毒復(fù)制、抗蛇毒、治療帕金森癥等功能[4]。因此，黑色素在化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。

目前，已從黑木耳[5]、黑芝麻[6]、桂花種子皮[7]、黑糯米[8]等天然黑色素食品中提取出黑色素，但有關(guān)花椒籽中黑色素提取和開(kāi)發(fā)利用的研究報(bào)道還很少。因此，本試驗(yàn)研究花椒籽中黑色素提取工藝，為花椒籽黑色素的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

花椒籽（產(chǎn)自山西運(yùn)城夏縣）；氫氧化鈉（A.R）；濃鹽酸（A.R）；無(wú)水乙醇（A.R）。

AF1104型電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；101A-1E型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水多用真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)工藝流程

原料→預(yù)處理→按比例加入提取劑→水浴浸提→過(guò)濾→定容→比色

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究首先確定提取花椒籽黑色素最佳提取溶劑、提取液最大吸收波長(zhǎng)。然后通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究提取液濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比及提取次數(shù)對(duì)黑色素提取效果的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取對(duì)花椒籽黑色素得率影響明顯的因素：A提取溫度/℃、B提取時(shí)間/min、C料液比/g/mL進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels for L9（33）

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑的確定

不同提取溶液對(duì)黑色素提取效果結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取溶劑對(duì)黑色素得率的影響Table 2 Effect of extraction solvent on the yield of melanin

在提取溫度20 ℃、提取時(shí)間48h、料液比1∶10（g/mL）、提取次數(shù)1次的條件下，用不同的提取溶劑對(duì)花椒籽黑色素進(jìn)行提取。提取結(jié)果如表2所示。確定氫氧化鈉溶液為提取花椒籽黑色素的溶劑。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)確定

為確定最佳花椒籽黑色素溶液吸收波長(zhǎng)，用不同濃度氫氧化鈉溶液提取花椒籽黑色素，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 花椒籽黑色素溶液吸收光譜Fig.1 The absorb curve of the melanin

在料液比1∶10（g/mL）、提取溫度 20℃、提取時(shí)間4.5 h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溶劑NaOH溶液濃度與最大吸收波長(zhǎng)的關(guān)系。從圖1可以看出：不同濃度提取液，最大吸收波長(zhǎng)基本一致。隨著波長(zhǎng)的增大，吸光度出現(xiàn)了2個(gè)高峰，第1個(gè)峰值出現(xiàn)在波長(zhǎng)250 nm處；第2個(gè)峰值出現(xiàn)在波長(zhǎng)550 nm處。進(jìn)一步細(xì)化研究條件，得出當(dāng)波長(zhǎng)為212 nm、540nm時(shí)，吸光度出現(xiàn)高峰。212 nm處吸光值不穩(wěn)，且其吸光值比540 nm處值小，結(jié)合相關(guān)資料[9]，本試驗(yàn)選540 nm作為最大吸收波長(zhǎng)。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 提取溶劑濃度對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響

提取溶劑氫氧化鈉濃度對(duì)花椒籽黑色素得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度對(duì)黑色素得率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the yield of melanin

在料液比1∶10（g/mL）、提取溫度20℃、提取時(shí)間4.5 h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溶劑NaOH溶液濃度與吸光度的關(guān)系。由圖2可以看出，隨著NaOH溶液濃度的增加，提取液吸光度在不斷升高。當(dāng)NaOH溶液濃度達(dá)到0.35 mol/L時(shí)，吸光值達(dá)到最高。隨后吸光值會(huì)逐漸下降。這是因?yàn)镹aOH溶液濃度升高有助于花椒籽黑色素的提取，但當(dāng)NaOH濃度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)提取出更多雜質(zhì)，黑色素也可能與別的物質(zhì)反應(yīng)，使其結(jié)構(gòu)受到破壞。從而導(dǎo)致吸光值降低[10]。

2.3.2 提取溫度對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響

提取溫度對(duì)花椒籽黑色素得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同溫度對(duì)黑色素得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of melanin

在料液比 1∶10（g/mL）、0.35 mol/L NaOH 溶液、提取時(shí)間4.5 h、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取溫度與吸光度的關(guān)系。由圖3可以看出，提取溫度對(duì)花椒籽黑色素得率有一定的影響，隨著溫度的升高，花椒籽黑色素得率增加，在65℃達(dá)到最大值，但當(dāng)溫度超過(guò)65℃時(shí)，隨著溫度的升高，黑色素得率呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)椋褐参锖谏厥且活愑煞宇悊误w組成的大分子物質(zhì)，具有還原性，易氧化，前人研究表明，在氧化過(guò)程中，酚羥基轉(zhuǎn)變?yōu)轷?0℃及以下溫度對(duì)總酚含量的影響無(wú)顯著差異，但在60℃以后，酚類物質(zhì)就會(huì)發(fā)生變化[11]，即黑色素結(jié)構(gòu)被破壞。

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響

提取時(shí)間對(duì)花椒籽黑色素得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同時(shí)間對(duì)黑色素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of melanin

在料液比1∶10g/mL、0.35 mol/L NaOH溶液、提取溫度65℃、提取次數(shù)1次的條件下，研究提取時(shí)間與吸光度的關(guān)系。由圖4可以看出，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花椒籽黑色素得率呈上升趨勢(shì)，在4.5 h達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)，這也可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黑色素的分解[6]。而且，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)帶來(lái)其他雜質(zhì)，會(huì)增加后續(xù)精制處理的步驟。

2.3.4 料液比對(duì)花籽中黑色素得率的影響

料液比對(duì)花椒籽黑色素得率的影響見(jiàn)圖5。

在0.35 mol/L NaOH溶液、提取溫度65℃、提取時(shí)間4.5 h、提取次數(shù)1次的條件下，研究料液比與吸光度的關(guān)系。由圖5可以看出，在一定的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，花椒籽黑色素的得率呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)榧铀吭酱髣t提取出來(lái)的黑色素就越容易溶解，損失就越少，在1∶30時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后隨著料液比的繼續(xù)增加，花椒籽黑色素得率不再增加，稍呈下降趨勢(shì)，這是可能因?yàn)殡S著料液比的增加，會(huì)帶入雜質(zhì)。

圖5 不同料液比對(duì)黑色素得率的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on the yield of melanin

2.3.5 提取次數(shù)對(duì)花椒籽中黑色素得率的影響

在料液比 1∶10（g/mL）、0.35mol/LNaOH 溶液、提取溫度65℃、提取時(shí)間4.5 h的條件下，研究提取次數(shù)與吸光度的關(guān)系。理論上，黑色素得率應(yīng)該隨著提取次數(shù)的增加而變大，提取次數(shù)越多，提取越充分，直到得率趨于平衡。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：在試驗(yàn)條件下，提取次數(shù)增加，得率變化不大。一次提取吸光值為：0.395 7，二次提取吸光值為：0.400 7，三次提取吸光值為：0.400 8。說(shuō)明一次提取近乎完全，再增加提取次數(shù)浪費(fèi)原料、溶劑和勞動(dòng)力。因此，綜合考慮，提取次數(shù)確定為1次為宜。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以提取溫度A、料液比B、提取時(shí)間C為自變量，以花椒籽黑色素提取液吸光度為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3，顯著性分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 L9（33）實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果表Table 3The design and results of L9（33）experiments

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 ANOVA for orthogonal experiment

從表4中可以看出，各因素及其水平對(duì)花椒籽中黑色素提取的影響表現(xiàn)出一定的差異。提取溫度對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響顯著，而其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。正交表直觀分析結(jié)果表明：影響提取花椒籽中黑色素的因素的主次順序?yàn)闇囟龋ˋ）＞料液比（B）＞時(shí)間（C），說(shuō)明溫度是影響得率的主要因素，其次為料液比，而時(shí)間的各水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響并不大；從平均值k來(lái)看，A因素中第1水平最好，B因素中第2水平最好，C因素中第2水平最好，所以最佳組合為A1B2C2，即提取溫度為60℃，料液比為1∶35，提取時(shí)間為4.5 h效果最好，與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果相符。在此條件下，黑色素提取液的吸光值為0.345。

3 結(jié)論

1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NaOH溶液為最佳提取溶劑。

2）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三因素影響花椒籽黑色素得率的主次順序是，溫度（A）＞料液比（B）＞時(shí)間（C）其中提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，其他因素影響不顯著。

3）花椒籽黑色素的最佳提取工藝參數(shù)為：0.35mol/L NaOH溶液為提取溶劑，浸提溫度60℃，料液比1∶35（g/mL），浸提時(shí)間4.5 h，提取1次。在此工藝條件下花椒籽黑色素的的吸光度可達(dá)0.345。

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Research on Optimizing Extraction Method of Prickly Ash Seed Melanin by Orthogonal Array Design Tests

XU Wen－xiu，WANG Peng，WANG Xiao－yan
（Department of Life－science，Yuncheng University，Yuncheng 044000，Shanxi，China）

Abstract：In order to improve the economic benefits and social value of the prickly ash seed and fully use of this resource，the melanin was extracted from prickly ash seed by solvents in this paper.The influences of various factors on the obtaining ratio of prickly ash seed melanin were studied by single factor test，such as solution concentration，extraction temperature，ratio of solid to liquid and extraction time.Absorbance was selected as a substitute of melanin content.The optimize extraction process were determined by orthogonal experiments.The results showed that： the order of factors affected melanin yield from prickly ash seed was： temperature＞ ratio of solid to liquor＞ time.The optimum extraction temperature，the optimum extraction time，ratio of solid to liquid，extraction times were 60℃，4.5 h，1∶35（g/mL）and 1 times.The absorbance was as high as 0.345.

Key words：prickly ash seed；melanin；extraction；orthogonal array

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.014

運(yùn)城學(xué)院院級(jí)項(xiàng)目（CY－2012010）

徐文秀（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：野生植物資源開(kāi)發(fā)利用。

2012-10-20