孔美蘭，劉謀泉，孔德虎，袁秀霞，林繼娜，沈少游，吳悅婷

（1.韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州 521041；2.泰興市一鳴生物制品有限公司，江蘇泰興 225433）

超聲波輔助酶法水解尋氏肌蛤蛋白

孔美蘭1，劉謀泉1，孔德虎2，袁秀霞1，林繼娜1，沈少游1，吳悅婷1

（1.韓山師范學(xué)院生物系，廣東潮州 521041；2.泰興市一鳴生物制品有限公司，江蘇泰興 225433）

摘 要：采用超聲波輔助中性蛋白酶水解尋氏肌蛤，以-氨基態(tài)氮含量為檢測(cè)指標(biāo)。首先采用單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)L9（34）確定酶法水解薄殼肉蛋白的最適條件．研究結(jié)果為：pH6.5，水解時(shí)間5 h，溫度55℃，酶濃度2.0%，料液比1∶2，水解液的α-氨基態(tài)氮含量為0.372 6 g/100 mL。在此基礎(chǔ)上，研究功率300 W的超聲波預(yù)處理對(duì)酶解效果的影響，綜合考慮，采用超聲波預(yù)處理10 min，α-氨基態(tài)氮含量提高到0.394 1 g/100 mL。

關(guān)鍵詞：尋氏肌蛤；中性蛋白酶；超聲波；酶解

尋氏肌蛤（Musculus senhousei），俗稱薄殼，具有易養(yǎng)殖，生長(zhǎng)快，產(chǎn)量大，價(jià)格低的特點(diǎn)。汕頭大學(xué)研究人員研究發(fā)現(xiàn)，薄殼蛋白質(zhì)含量高達(dá)10.48%，比有“海洋牛奶”之稱的牡蠣還高出近一倍；組成氨基酸比例合理；礦物質(zhì)含量明顯高于其他海洋貝類生物，尤其具有抗癌作用的元素硒含量很高，是一種優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白資源[1]。

尋氏肌蛤在每年的5、6月份大量上市，主要用于鮮食，少量經(jīng)粗加工成薄殼米出售或者作為優(yōu)質(zhì)海魚魚苗期飼料[2]。集中上市時(shí)，由于鮮食量有限，造成薄殼大量積壓，價(jià)格一再走低，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶增產(chǎn)不增收。因此有必要進(jìn)行薄殼深加工的研究。

由于尋氏肌蛤是潮汕地區(qū)的特有資源，所以目前對(duì)其加工利用方面的研究幾乎沒(méi)有。本研究對(duì)尋氏肌蛤蛋白通過(guò)酶解將大分子蛋白質(zhì)降解為多肽、小肽及氨基酸，以利于人體的消化吸收，或者作為方便食品的海鮮調(diào)味料的主要原料，以及可以作為食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，可大大提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，同時(shí)也有利于其貯存。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

尋氏肌蛤：購(gòu)于潮州楓春水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；中性蛋白酶（南寧龐博生物技術(shù)有限公司，酶活力3 000 U/mg）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

TD-5型臺(tái)式離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；pH S-25型酸度計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；WFZUV-2102PC紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）上海儀器有限公司；SB-5200超聲波清洗機(jī)（300 W）：上海新芝生物技術(shù)研究所；JJ-2型組織搗碎機(jī)：江蘇省金壇市榮華儀器有限公司；控溫式磁力攪拌器：常州國(guó)華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

尋氏肌蛤→蒸煮→脫殼、取肉→稱量→調(diào)節(jié)pH→按比例加入酶→（超聲波處理）→在一定溫度下水解→滅酶（沸水浴10 min）→冷卻至室溫→離心10 min收集上清液→測(cè)定α-氨基態(tài)氮含量

（注：超聲波處理在酶解試驗(yàn)的單因素和優(yōu)化試驗(yàn)中不做。）

1.3.2 分析檢測(cè)方法

蛋白酶活力的測(cè)定[3]：福林酚法；粗蛋白[4]：微量凱氏定氮法；氨基態(tài)氮含量[4]：甲醛滴定法。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 單因素對(duì)中性蛋白酶酶解效果的影響

1）料液比對(duì)酶解效果的影響

分別采用料液比為 1∶ 1；1∶1. 5；1∶ 2；1∶2. 5；1∶3（g/mL），在 pH7.0，溫度 50℃，酶濃度為 1.0%，水解時(shí)間為6 h條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，研究料液比對(duì)酶解效果的影響。

2）酶濃度的影響

根據(jù)以上試驗(yàn)，設(shè)定料液比為1∶2，在pH7.0，溫度50℃，改變酶濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，然后水解6 h，研究酶濃度對(duì)酶解效果的影響。

3）溫度對(duì)酶解效果的影響

根據(jù)以上試驗(yàn)，設(shè)定中性蛋白酶酶濃度1.5%，料液比為 1∶2，pH7.0，分別于 40、45、50、55、60、65 ℃條件下水解時(shí)間6 h，研究溫度對(duì)水解度的影響。

4）pH對(duì)酶解效果的影響

根據(jù)以上試驗(yàn)，設(shè)定中性蛋白酶酶濃度1.5%，料液比為 1∶2，溫度 55 ℃，分別在 pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等不同pH中進(jìn)行酶解6 h，研究不同的pH對(duì)酶解效果的影響。

5）時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

根據(jù)以上試驗(yàn)，設(shè)定中性蛋白酶酶濃度1.5%，料液比為1∶2，溫度55℃，pH7.0，分別在水解時(shí)間為2、3、4、5、6、7、8 h 條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，研究酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響。

1.3.3.2 中性蛋白酶最佳工藝條件的確定[5]

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，酶濃度、水解時(shí)間、水解溫度、體系pH以及料液比均對(duì)酶解效果有一定的影響。考慮到酶解過(guò)程是受到以上各因素的綜合影響，因此進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以確定其最佳酶解條件，其中料液比固定在1∶2。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 中性蛋白酶的正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Level and factors of hydrolyzation of neutral proteinase

1.3.3.3 超聲波輻射對(duì)酶解效果的影響

在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究額定功率300 W的超聲波預(yù)處理對(duì)后期蛋白質(zhì)水解效果的影響。試驗(yàn)采用超聲波清洗機(jī)對(duì)酶解前的料液分別作用10、20、30 min，接著在最佳條件下進(jìn)行水解。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性蛋白酶酶解條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)酶解效果的影響

料液比對(duì)酶解效果的影響，見圖1。

圖1 料液比對(duì)水解效果影響曲線Fig.1 Effect of ratio of solid and liquid on hydrolyzation

由圖1可知，隨著料液比值的降低，反應(yīng)體系中的水分增加，α-氨基態(tài)氮的生成量逐漸升高，直至料液比為1∶2時(shí)達(dá)到最高，之后隨著料液比值的繼續(xù)下降，α-氨基態(tài)氮生成量下降。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因是，隨著料液比的下降，反應(yīng)體系中水分會(huì)增加，從而降低了反應(yīng)產(chǎn)物的濃度，減輕了產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的抑制作用。但是，隨著反應(yīng)體系中水分的增加，酶的濃度相應(yīng)的會(huì)下降影響了α-氨基態(tài)氮的進(jìn)一步提高。因此選擇料液比為1∶2。

2.1.2 酶濃度的影響

酶濃度對(duì)水解效果的影響，見圖2。

圖2 酶濃度對(duì)水解效果影響曲線Fig.2 Effect of density of protease on hydrolyzation

由圖2可看出，隨著酶濃度的增加α-氨基酸態(tài)氮含量在不斷升高，當(dāng)酶濃度超過(guò)1.5%繼續(xù)增加酶濃度時(shí)，α-氨基酸態(tài)氮含量增加不明顯。從節(jié)約成本考慮，將酶濃度設(shè)定為1.5%。

2.1.3 溫度對(duì)酶解效果的影響

溫度對(duì)酶解效果的影響，見圖3。

圖3 水解溫度對(duì)水解效果影響曲線Fig.3 Effect of temperature on hydrolyzation

由圖3可知：從溫度40℃升到55℃的過(guò)程，α-氨基態(tài)氮含量急劇增加；在超過(guò)55℃以后，隨溫度的上升，α-氨基態(tài)氮含量有所下降，分析原因可能是溫度過(guò)低，酶活比較低；而溫度過(guò)高則導(dǎo)致酶逐漸失活。因此選擇水解溫度為55℃。

2.1.4 pH對(duì)酶解效果的影響

pH對(duì)酶解效果的影響，見圖4。

圖4 pH對(duì)水解效果影響曲線Fig.4 Effect of pH on hydrolyzation

由圖4中可看出，pH5.0時(shí)α-氨基態(tài)氮含量相當(dāng)?shù)停砻鞯鞍酌冈诘蚿H值時(shí)作用不明顯。隨pH的升高，酶解產(chǎn)物中α-氨基態(tài)氮含量不斷升高。當(dāng)pH處于7.0左右時(shí)候酶解效果最好，而當(dāng)pH值超過(guò)8.0繼續(xù)升高時(shí)，α-氨基態(tài)氮含量反而下降。因此選擇pH7.0為最佳條件。

2.1.5 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

時(shí)間對(duì)酶解效果的影響，見圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)水解效果影響曲線Fig.5 Effect of time on hydrolyzation

由圖5可知，反應(yīng)開始的2 h內(nèi)，反應(yīng)速度較慢，所以α-氨基態(tài)氮含量增加幅度較?。辉? h～5 h之間α-氨基態(tài)氮增加幅度有所增強(qiáng)；超過(guò)5 h之后α-氨基態(tài)氮基本上無(wú)變化，水解基本完成。此外，從節(jié)省能耗和防止水解液變質(zhì)方面來(lái)考慮，控制反應(yīng)的最佳時(shí)間在4 h～6 h之間。

2.2 中性蛋白酶最佳工藝條件的確定

表2 中性蛋白酶酶解條件L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析Table 2L9（43）orthogonal design and result of hydrolyzation of neutral proteinase

由表2可知，加酶量是影響水解效果的最主要因素，pH是次要因素，水解時(shí)間和溫度對(duì)酶解程度的影響較小。單從α－氨基態(tài)氮含量來(lái)考慮，最佳處理?xiàng)l件為 A2B1C2D3，即 55℃，pH6.5，加酶量 2.0%，水解時(shí)間為5 h。在此最適條件下水解，測(cè)定水解液的α－氨基態(tài)氮含量為0.372 6 g/100 mL＞0.349 5 g/100 mL（正交表中的最大值），說(shuō)明正交試驗(yàn)成功，結(jié)果可靠。

2.3 超聲波輻射對(duì)酶解的影響

朱國(guó)輝[6]等報(bào)道，超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)，加速了介質(zhì)中的質(zhì)量傳遞作用。這有利于反應(yīng)底物進(jìn)入酶的催化部位及產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)的傳質(zhì)作用，從而表現(xiàn)出酶活性的增加。同時(shí)，適宜的聲場(chǎng)作用也會(huì)使蛋白酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，使其折疊更合理，更容易與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物，從而提高酶的催化活力。

圖6 超聲波預(yù)處理對(duì)蛋白水解效果的影響Fig.6 Effect of ultrasonic pretreatment on hydrolyzation

由圖6可知，經(jīng)超聲波處理后，當(dāng)超聲波作用時(shí)間在20 min內(nèi)時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)α－氨基態(tài)氮生成量增加；當(dāng)作用時(shí)間在20 min至30 min之間時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)α－氨基態(tài)氮生成量有所降低。這是由于，短時(shí)間的超聲波作用使內(nèi)源蛋白酶組織發(fā)生了破裂，有利于酶與蛋白質(zhì)的接觸，體現(xiàn)出作用后水解效果有所改善[6]。當(dāng)超聲波作用達(dá)到一定能量水平時(shí)，破碎酶組織的同時(shí)進(jìn)一步破壞了酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)而致使部分酶失活，起到一定的負(fù)作用。當(dāng)這種負(fù)作用大于激活作用時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出α－氨基態(tài)氮生成量有所下降，表現(xiàn)出超聲波作用20 min的激活效果最好。由于超聲波10 min與20 min相比差距不大，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，采用超聲波10 min預(yù)處理，水解液中α－氨基態(tài)氮含量為0.394 1 g/100 mL。

3 結(jié)論

1）試驗(yàn)采用中性蛋白酶對(duì)薄殼肉進(jìn)行酶解，通過(guò)影響酶解效果的幾個(gè)因素進(jìn)行單因素和優(yōu)化試驗(yàn)，最終得出薄殼肉蛋白水解的最佳條件為：pH6.5，水解時(shí)間5 h，溫度55℃，酶濃度2.0%，料液比1∶2，水解液的α－氨基態(tài)氮含量為0.372 6 g/100 mL。

2）為了進(jìn)一步提高水解效果，在確定的最佳水解條件下，采用超聲波預(yù)處理激活內(nèi)源酶的活力。試驗(yàn)表現(xiàn)功率為300 W的超聲波作用20 min的激活效果最好，從節(jié)約能源角度考慮，最終采用超聲波10 min預(yù)處理，α－氨基態(tài)氮含量提高到0.394 1 g/100 mL，為進(jìn)一步綜合利用提供了大量的氨基酸和小肽。

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[1]佘綱哲,傅明輝.尋氏肌蛤營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].海洋科學(xué),1996(5):9－11

[2]蔡英亞.尋氏肌蛤的養(yǎng)殖和利用[J].水產(chǎn)與教育,1975(1):9－11

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[6]朱國(guó)輝,黃卓烈,徐鳳彩,等.超聲波對(duì)菠蘿果蛋白酶活性和光譜的影響[J].應(yīng)用聲學(xué),2003,22(6):10－14

Enzymolysis of Protein from Musculus Senhousei Assisted by Ultrasonic

KONG Mei-lan1，LIU Mou-quan1，KONG De-hu2，YUAN Xiu-xia1，LIN Ji-na1，SHEN Shao-you1，WU Yue-ting1
（1.Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China；2.Taixing Yiming Biological Products Co.，Ltd.，Taixing 225433，Jiangsu，China）

Abstract：Using enzymatic extraction methods assisted by ultrasonic to enzymolysisMusculus senhousei， αamino nitrogen content was the index.Firstly，the hydrolysis ofMusculus senhouseiby neutral proteinase through single element experiment and L9（34） orthogonal study were studied.The results showed that optimum hydrolysis conditions were：pH 6.5，hydrolysis time 5 h，temperature 55℃，content of enzyme 2.0%，the solid/liquid ratio was 1∶2.The content of α-amino acid was 0.372 6 g/100 mL.On this basis， we studied the effect of pretreatment on hydrolysis using ultrasonic of 300 W power.The results showed that 10 minters ultrasonic pretreatment can improve enzymolysis evidently and the content of α-amino acid was 0.394 1 g/100 mL.

Key words：Musculus senhousei； neutral proteinase； ultrasonic； enzymolysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.006

韓山師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（LQ200807）

孔美蘭（1977—），女（漢），講師，碩士，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。

2013－07－23