● 周京旭 林麗珠▲ 王淑美

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益氣除痰方下調(diào)vimentin表達(dá)與逆轉(zhuǎn)EMT相關(guān)性研究※

● 周京旭1林麗珠1▲王淑美2

目的：觀察益氣除痰方肺癌腫瘤生長(zhǎng)、肺轉(zhuǎn)移的影響，并通過差異蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出差異表達(dá)蛋白vimentin，并結(jié)合相關(guān)技術(shù)分析其可能的意義。方法：C57BL小鼠40只，接種Lewis肺癌細(xì)胞，造模第2天，隨機(jī)分為對(duì)照組(生理鹽水)和低、中、高劑量觀察組予益氣除痰方1.0g·kg-1·d-1，3.0g·kg-1·d-1，9.0g·kg-1·d-1，每組10只，灌胃21d后，檢測(cè)腫瘤體積、重量、肺轉(zhuǎn)移灶，分別提取最佳劑量治療組和模型組腫瘤組織的總蛋白，應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)系統(tǒng)獲得蛋白點(diǎn)表達(dá)差異信息，運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-TOF)鑒定出差異蛋白質(zhì)。并以熒光定量PCR和Western blot法對(duì)差異蛋白進(jìn)行表達(dá)差異鑒定。培養(yǎng)A549細(xì)胞，20%益氣除痰方含藥血清干預(yù)，劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的改變，RT-PCR檢測(cè)其對(duì)A549肺癌細(xì)胞MMP-1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA基因表達(dá)的影響。結(jié)果：益氣除痰方3.0g·kg-1·d-1治療組腫瘤體積、瘤重、肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)均明顯小于LEWIS模型組(P<0.01)，腫瘤抑制率為57.21%。蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定受益氣除痰方調(diào)控影響的蛋白37個(gè)，其中vimentin下調(diào)尤其明顯。20%益氣除痰方含藥血清可抑制A549細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并能降低MMP2、MMP14mRNA基因的表達(dá)，與空白組比較差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)論：益氣除痰方明顯下調(diào)vimentin表達(dá)，抑制A549細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，減少基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP14的分泌，這可能與益氣除痰方逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

益氣除痰方 LEWIS肺癌 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，上皮細(xì)胞標(biāo)志——E-鈣黏素和細(xì)胞角蛋白的表達(dá)受到抑制，而誘導(dǎo)表達(dá)一種間葉細(xì)胞骨架中間纖維組成成分波形蛋白(vimentin)，同時(shí)獲得分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的能力[1,2]。益氣除痰方由黨參、生法夏、守宮、露蜂房等組成，通過健脾益氣、化痰散結(jié)達(dá)到固本抑瘤、兼治標(biāo)本的功效。臨床研究證明，益氣除痰方能夠明顯延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌肺癌患者的生存期，提高生存質(zhì)量。其療效既和抑制肺癌的生長(zhǎng)有關(guān)，也和降低肺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，使患者能較長(zhǎng)期的“帶瘤生存”，達(dá)到治療目的[3,4]。

本實(shí)驗(yàn)采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，鑒定分析發(fā)現(xiàn)益氣除痰方明顯降低LEWIS肺癌細(xì)胞vimentin的表達(dá)，并進(jìn)一步分析了調(diào)節(jié)vimentin表達(dá)的意義。

1 材料與方法

1.1材料益氣除痰方(Yiqi Chutan Tang，YQCT)按組成嚴(yán)格稱取鑒定。經(jīng)煮液，過濾，濃縮至含生藥量2g/ml，密閉4℃保存?zhèn)溆?。Cy Dye熒光染料(Cy 2，Cy 3，Cy 5)、CHAPS、兩性電解質(zhì)(pH 3～10 NL)、DTT、24cm IPG 膠條(pH 3～10 NL)、碘乙酰胺(IAA)、Clean-up試劑盒、2D Quant試劑盒等均購(gòu)自AmershamBioscience公司。IPG-phorⅡ等電聚焦儀、DALT Six電泳系統(tǒng)、Typhoon9400系列多功能激光掃描成像系統(tǒng)、DeCyder差異分析軟件和MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜均為Amersham Bio science公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 造模與給藥 SPF級(jí)C57BL小鼠40只，18～20g，雌雄各半。C57BL小鼠d1右腋皮下接種1×107個(gè)Lewis肺癌細(xì)胞。接種d2開始用藥，治療組予益氣除痰方1.0g·kg-1·d-1，3.0g·kg-1·d-1，9.0g·kg-1·d-1，灌胃，給藥量為0.5mL/只，每天1次，連續(xù)灌胃21d；對(duì)照組予生理鹽水。接種后每3d稱量一次體重，d 22處死小鼠，檢測(cè)各組腫瘤體積、重量、肺轉(zhuǎn)移灶，取腫瘤組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙向電泳[5]用蛋白裂解液提取中劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛋白，用改良的Bradford法測(cè)定提取蛋白樣品的蛋白濃度。熒光標(biāo)記G1對(duì)照組(CY3)，治療組(CY5)，CY2標(biāo)記內(nèi)標(biāo)；G2膠反標(biāo)記對(duì)照組(CY5)，治療組(CY3)，CY2標(biāo)記內(nèi)標(biāo)。將上述三個(gè)標(biāo)記好的樣品混合，進(jìn)行等點(diǎn)聚焦、SDS-PAGE電泳。凝膠圖像分析，篩選出在兩組中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。

1.2.3 制備質(zhì)譜樣品及質(zhì)譜分析 將G1、G2膠進(jìn)行質(zhì)譜分析，蛋白質(zhì)原位酶解，MALDI-TOF-TOF肽質(zhì)量指紋圖測(cè)定，蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)查詢通過Internet在ExPASY的Peptdent軟件進(jìn)行搜尋。選擇合適參數(shù)，進(jìn)行匹配。Western blot驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 劃痕細(xì)胞遷移試驗(yàn)[6]6孔板長(zhǎng)滿細(xì)胞單

層后，用滅菌10uL槍頭沿細(xì)胞中部劃一條直線，洗去細(xì)胞碎片，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，治療組予20%含藥血清，對(duì)照組予20%無藥血清，相差顯微鏡觀察劃痕愈合程度，計(jì)算遷移率=1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100%。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)MMP-1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA的表達(dá)[6]A549細(xì)胞經(jīng)20%含藥血清處理24h，Trizol法總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)置PCR擴(kuò)增條件為：94℃2分鐘；94℃25秒；55℃30秒；72℃30秒；72℃5秒，循環(huán)25次。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%的瓊脂糖電泳后，紫外燈觀察拍照。Quantity one軟件分析定量。見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1益氣除痰方對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響無論腫瘤體積、瘤重、肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)益氣除痰方治療組均明顯小于對(duì)照組組(P<0.01)，其中，中劑量組3.0g·kg-1·d-1腫瘤抑瘤效果最好，最大抑瘤率57.21%。見表2。

表2 益氣除痰方治療21天對(duì)小鼠Lewis肺癌實(shí)體瘤生長(zhǎng)的影響

注：與LEWIS肺癌模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2 2D-DIGE膠圖分析結(jié)果分析以統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)：差異參數(shù)T-TEST<0.05，差異倍數(shù)參數(shù)：RITIO<-1.5or>1.5為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出治療組與對(duì)照差異蛋白點(diǎn)44個(gè)，其中治療后上調(diào)表達(dá)蛋白6個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白38個(gè)。

2.3質(zhì)譜鑒定結(jié)果治療組與對(duì)照組44個(gè)差異表達(dá)蛋白經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定出37個(gè)蛋白，其中波紋蛋白vimentin下調(diào)表達(dá)最顯著。見表3。

表3 治療組vimentin的差異表達(dá)

2.4 Western blot法對(duì)部分差異蛋白鑒定結(jié)果顯示益氣除痰治療組，vimentin，prolyl 4-hydroxylase，protein disulfide-isomerase A3 precursor，EG433182 protein表達(dá)水平較模型組下降，與蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。見圖1。

圖1益氣除痰方對(duì)小鼠Lewis肺癌組織表達(dá)Vimentin的影響(內(nèi)參為β-Actin)(Western blot，n=10)

2.5益氣除痰方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響12h后，20%含藥血清組A549細(xì)胞遷移率分別為(18.6±2.8)%，對(duì)照組為(43.3±2.9)%；24h后，20%含藥血清組細(xì)胞的遷移率分別為(43.1±3.3%)，對(duì)照組已經(jīng)長(zhǎng)滿。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.6益氣除痰方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞MMP1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，治療組可明顯降低MMP2、MMP14 mRNA的表達(dá)，有顯著性差異(P<0.01)，而MMP1、MMP9mRNA的表達(dá)改變不明顯，無顯著性差異(P<0.01)。見圖2。

圖2 益氣除痰方含藥血清對(duì)A549細(xì)胞MMP1、MMP2、MMP9、MMP14mRNA的影響

3 討論

肺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，是其治療失敗的主要原因之一。而腫瘤細(xì)胞必須獲得侵襲轉(zhuǎn)移的能力，突破基底膜，必須由上皮形態(tài)轉(zhuǎn)化為間質(zhì)形態(tài)，因而上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。癌細(xì)胞發(fā)生上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，喪失了上皮細(xì)胞極性，E-鈣黏素和細(xì)胞角蛋白的表達(dá)受到抑制；獲得了成纖維細(xì)胞形態(tài)，運(yùn)動(dòng)侵襲能力、N-鈣黏素和波形蛋白表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶和纖連蛋白分泌。EMT通常由腫瘤所處的環(huán)境信號(hào)激發(fā)。也就是說，處于原發(fā)灶侵襲性前緣的腫瘤細(xì)胞可以從鄰近的反應(yīng)性基質(zhì)中獲得特異性信號(hào)，從而獲得向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力[1,2]。事實(shí)上，多種惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、腸癌等的侵襲轉(zhuǎn)移過程均觀察到EMT現(xiàn)象，而且腫瘤組織中的發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞數(shù)目直接與病變組織的侵襲轉(zhuǎn)移程度相關(guān)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。用EMT調(diào)節(jié)因子Twist處理后乳腺癌細(xì)胞，Ax1表達(dá)上調(diào)，侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)[7]；過表達(dá)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail/Twist可促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增加，而沉默Snail/Twist，使肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制[8]。而肺癌發(fā)生EMT促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥，不僅是化療藥物，也包括對(duì)分子靶向藥物EGFR TkI的耐藥。肺腺癌細(xì)胞株A549經(jīng)TGF-β1孵育21天以后，轉(zhuǎn)變?yōu)镋MT表型的A549-M，其遷徙、轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)[9]。而用RNAi抑制Snail后，則明顯降低其體外侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]。

益氣除痰方可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，減少肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移的首要條件。因而理論上推測(cè)益氣除痰方是也抑制A549細(xì)胞EMT的發(fā)生?？梢詮囊韵聨讉€(gè)方面進(jìn)行探討：(1)腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生了形態(tài)學(xué)的變化，如從梭形細(xì)胞變成圓形細(xì)胞；(2)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力是否發(fā)生改變；(3)一些上皮和間葉組織的細(xì)胞標(biāo)志物是否發(fā)生改變。

研究表明，腫瘤侵襲前緣的癌細(xì)胞選擇性表達(dá)Vimentin，細(xì)胞也變成一種拉伸的纖維母細(xì)胞形態(tài)，而內(nèi)部的癌細(xì)胞不表達(dá)Vimentin，細(xì)胞也維持上皮樣形態(tài)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)益氣除痰方可明顯抑制Vimentin表達(dá)，可能使細(xì)胞保持上皮樣形態(tài)，也可能與抑制腫瘤上皮向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。

其次，細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的下降，基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌減少也是抑制EMT的表現(xiàn)之一。用益氣除痰方含藥血清處理人肺癌A549細(xì)胞株，劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能明顯抑制細(xì)胞的遷移；同時(shí)RT-PCR也發(fā)現(xiàn)益氣除痰方含藥血清降低MMP-2、MMP-14mRNA基因的表達(dá)。而基質(zhì)金屬蛋白酶是細(xì)胞突破基底膜，在細(xì)胞外基質(zhì)中運(yùn)動(dòng)最重要的效應(yīng)分子[11]。

一些上皮和間葉組織的細(xì)胞標(biāo)志物比如E-cad和N-cad是否發(fā)生改變尚待檢測(cè)，但益氣除痰方逆轉(zhuǎn)EMT抑制肺癌轉(zhuǎn)移、耐藥現(xiàn)象，將成為今后工作新的重點(diǎn)領(lǐng)域。

[1]Micalizzi DS，F(xiàn)arabaugh SM，F(xiàn)ord HL.Epithelial-mesenchymal transition in cancer：parallels between normal development and tumor progression.J Mammary Gland BIol Neoplasia，2010，15：117-134.

[2]Zeisberg M，Neilson EG.Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions.J Clin Invest 2009，119：1429-1437.

[3]周岱翰，林麗珠，周宜強(qiáng)，等.益氣除痰法延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌中位生存期的作用.中醫(yī)雜志，2005，46(8)：600-602.

[4]周岱翰，林麗珠，周宜強(qiáng)，等.中醫(yī)藥治療III-VI期非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后因素分析.癌癥，2005，24(10)：1252-1256.

[5]Shumei-Wang，Lizhu-Lin，Jingxu-Zhou，Shaoquan-Xiong. The effect of Yiqi Chutan Tang on proteome in LEWIS lung cancer in mice ASIAN PACIFIC JOURNAL OF CANCER PREVENTION.2011，12(7)：1665-1669.

[6]史海嶺，劉 芬，郭曉軍，等.黃連素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移與黏附的影響.中國(guó)癌癥雜志，2009，19(12)：910-914

[7]Gjerdrum C，Tiron C，Hoiby T，et al.Ax1 is an essential epithelial-to-mesenchymal transition-induced regulator of breast cancer metastasis and patient survival.Proc Natl ACad Sci USA，2010，107(3)：1124-1129.

[8]Yang MH，Chen CH，Chau GY，et al.Comprehensive analysis of the indepent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma.Hepatology，2009;50(5)：1464-1474.

[9]Maitah M Y，Ali S，Ahmad A.Up-Regulation of Sonic Hedgehog Contributes to TGF-b1-Induced Epithelial to Mesenchymal Transitionin NSCLC Cells.PLoS One，2011，6(1)：e16068.

[10]卓文磊，張?jiān)漆?，?彥，等.RNA干擾抑制Snail表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化及體外侵襲的影響.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008，16(6)：889-893.

[11]Delassus GS，Cho H，Hoang S，et al。Many new down- and up-regulatory sign aling pathways，from known cancer progression suppressors to matrix metalloproteinases，differ widely in cells of various cancers.J Cell Physiol，2010，224(2)：549-58.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30772862 )

林麗珠，女，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail：lizhulin903@21cn.com。

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院腫瘤科(510405)；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院(401331)

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