李 爍，鐘國強，何 艷，肖 飛，蔣智淵，蒙滋滋

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021)

房顫是最常見的心律失常之一，可導致心衰、中風等嚴重后果。近年來研究顯示，房顫還可加速癡呆的進程［1］。中國一項來源于29079例患者的房顫流行病學調(diào)查顯示，房顫患病率為0.77%，據(jù)推算目前房顫患病人數(shù)約為800萬［2］。M3受體是心房乙酰膽堿(ACh)受體中的一種，其直接介導的鉀離子電流(IkM3)與房顫電重構(gòu)直接相關(guān)。構(gòu)成細胞間直接通訊的縫隙連接(GJ)通道主要由縫隙連接蛋白(Cx)組成，心房中主要的Cx有兩個亞型:Cx40和Cx43。研究表明，房顫電重構(gòu)過程中M3受體與Cx43緊密相關(guān)。Cx43蛋白自身重構(gòu)及表達量下降可導致房顫的持續(xù)發(fā)作［3～5］。在心肌細胞膜上，M3受體與Cx43存在共定位關(guān)系，與磷酸化的Cx43蛋白相結(jié)合，Cx43與M3受體在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)［6］。本研究通過檢測于2012年3月～2013年2月收集的風濕性心臟病房顫患者及竇性心率患者右心房組織中M3受體與Cx43的表達，探討M3受體及Cx43與房顫的發(fā)生、維持的關(guān)系，為房顫發(fā)生機制的研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2012年3月～2013年2月行風濕性心臟病二尖瓣置換術(shù)患者94例，其中男51例、女43例。術(shù)前常規(guī)行心電圖、超聲心動圖等檢查，所有病例心功能均在Ⅱ～Ⅲ級(NYHA標準)，根據(jù)術(shù)前心電圖檢查是否并發(fā)房顫分為兩組，竇性心律組(SR組)45例，房顫組(AF組，房顫病史＞6個月)49例。病例選擇排除標準:①有感染性心內(nèi)膜炎;②臨床上有風濕性活動征象;③年齡＞55歲或＜18歲。④患有糖尿病、嚴重肝腎疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。

1.2 材料與試劑 實驗儀器:小型單垂直電泳槽(六一儀器廠，北京);蛋白轉(zhuǎn)移槽(Bio-RAD公司，美國);共聚焦顯微鏡(尼康公司，日本)。實驗試劑:兔 Cx43單克隆抗體(Sigma公司，美國);鼠Cx43單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國);兔M3受體多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國);鼠GAPDH抗體(康成生物公司，上海);辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG抗體(博士德公司，武漢);DyLight 405山羊抗兔抗體(Earth Ox，美國);FITC山羊抗鼠抗體(博士德公司，武漢);化學發(fā)光底物(PIERCE公司，美國);蛋白MARKER(Formentas公司，美國);蛋白雜交膜(millipore公司，美國);其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純試劑。

1.3 標本取材 全部標本均為術(shù)中獲取，取右心房心肌標本約100 mg，取材后速凍于液氮中，-80℃超低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測指標

1.4.1 M3受體及Cx43蛋白結(jié)構(gòu)共定位 采用激光共聚焦顯微鏡觀察。取兩組患者的右心房組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，分別制作成4 μm石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精浸泡后采用0.01 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH值6.0)高壓抗原修復10 min，浸泡30 min，冷卻10 min。正常山羊血清37℃封閉30 min，甩掉血清，滴加兔源多克隆M3受體抗體及鼠源單克隆Cx43蛋白抗體混合液，稀釋度為1∶100，4℃過夜孵育，后經(jīng)PBS漂洗3次，每次3 min后，37℃孵育DyLight 405標記的山羊抗兔二抗(1∶50)1 h，再次經(jīng)PBS漂洗3次，同樣條件再次孵育FITC標記的山羊抗鼠二抗(1∶50)，PBS漂洗后風干，抗熒光衰減封片劑封片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。孵育熒光二抗及之后的步驟均避光操作。采用激光共聚焦顯微鏡觀察，圖像采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析，計算反映M3受體及Cx43蛋白結(jié)構(gòu)共定位關(guān)系的皮爾森相關(guān)聯(lián)系數(shù)及重疊系數(shù)。

1.4.2 M3受體及 Cx43蛋白表達 采用 Western blot法檢測。取右心房組織經(jīng)稱量后重量約20 mg，每10 mg組織加入蛋白裂解液200 μL，經(jīng)勻漿、裂解、離心后取上清液置-20℃凍存。用BCA法進行蛋白濃度測定。取50 μg蛋白，在12%SDS-PAGE膠上電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶的TBST室溫搖動封閉2 h。分別加兔抗M3多克隆抗體(1∶200)、兔抗 Cx43 多克隆抗體(1∶1000)進行雜交，4℃孵育過夜。次日加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶10000稀釋)二抗室溫孵育1 h。以GAPDH為內(nèi)參照。加化學發(fā)光底物于膜上，反應1 min，暗室壓片，曝光后將膠片進行顯影，定影所得膠片結(jié)果經(jīng)Quantity One系統(tǒng)分析處理數(shù)據(jù)，計算反映蛋白表達量的灰度值相對量。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0，計量資料用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 右心房組織M3受體及Cx43蛋白結(jié)構(gòu)共定位系數(shù) 激光共聚焦顯微鏡下可見右心房組織中M3受體陽性表達呈藍色，主要以線性分布于心肌細胞膜處。Cx43陽性表達呈綠色短棒狀，分布以端—端連接為主，少數(shù)為側(cè)—側(cè)連接。AF組右心房組織中，皮爾森相關(guān)聯(lián)系數(shù)及重疊系數(shù)均高于SR組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組右心房組織M3受體及Cx43蛋白結(jié)構(gòu)共定位關(guān)系相關(guān)數(shù)比較()

表1 兩組右心房組織M3受體及Cx43蛋白結(jié)構(gòu)共定位關(guān)系相關(guān)數(shù)比較()

注:*與SR組相比，P＜0.05

組別 皮爾森相關(guān)系數(shù) 重疊系數(shù)AF 組 0.67 ±0.09* 0.93 ±0.01*SR組0.34 ±0.12 0.71 ±0.16

2.2 右心房組織M3受體及Cx43蛋白表達 與SR組相比，AF組在75 kD處出現(xiàn)的M3受體特異性條帶及34 kD處出現(xiàn)的Cx43特異性條帶均較細且淡，而SR組的相應條帶均較粗且濃，見圖1。AF組M3受體蛋白灰度值相對量為0.69±0.08，Cx43蛋白灰度值相對量為0.57±0.10，而在SR組中上述二蛋白的灰度值相對量分別為0.86 ±0.08及1.14±0.27，兩組相比 P 均 ＜0.05。

圖1 兩組心房組織M3受體蛋白及Cx43蛋白表達量

3 討論

在房顫的發(fā)生和維持機制中，最重要的為“房顫致房顫學說”，即房顫的發(fā)生可造成一系列的心房電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)則促進房顫的維持［7］。房顫的發(fā)生與有效不應期縮短為主要表現(xiàn)的電重構(gòu)相關(guān)，以有效不應期縮短為主要表現(xiàn)，與心肌細胞內(nèi)鈣離子電流減少及鉀離子電流增強有密切關(guān)系。

心房中 ACh受體有3種，即 M2、M3和 M4，可分別激活不同的鉀離子電流IKM2、IKM3、IKM4。其中IKM2主要參與靜息電位的形成，IKM3、IKM4是延遲整流鉀離子電流的成分，參與復極化過程。作為內(nèi)向整流的鉀離子電流主要成分之一的乙酰膽堿敏感的鉀離子電流IK-Ach，參與3期的快速復極和靜息電位的形成。在房顫的發(fā)展階段即持續(xù)性房顫時，IK-Ach增強可致使復極和靜息時鉀離子電流增加，復極加快，靜息膜電位負值增大，引起心房動作電位時間APD和有效不應期ERP縮短、各向異性增加，這是持續(xù)性房顫維持的基礎［8］。因此，M3受體所介導的電流IKM3直接參與復極化的過程，它的持續(xù)激活可促進房顫的發(fā)生與維持［9，10］。Tuomi等［11］通過敲除小鼠的G蛋白信號通路的調(diào)節(jié)蛋白(RGS)造成RGS缺失，導致GTP水解受阻使M3受體途徑持續(xù)激活，可增加房顫的易感性。Yeh等［12］發(fā)現(xiàn)，房速動物模型中左心房和肺靜脈M3受體表達下調(diào)，IkM3減弱，延遲整流內(nèi)向鉀離子電流下降，這是一個預適應機制，可使心房細胞有效不應期有所延長，進而可改善房顫電重構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，AF組患者右心房組織中M3受體表達量較SR組表達量低，AF組患者右心房組織中，Cx43蛋白表達量低于SR 組。Luo等［13］及Kostin 等［14］的實驗結(jié)果也證明，在房顫患者中，Cx43蛋白表達量較竇性心律患者降低。Cx43表達量下調(diào)可導致縫隙連接耦聯(lián)不良，并出現(xiàn)局部心肌的緩慢傳導及微折反，此為房顫維持機制的一個重要組成部分。有研究表明，采用免疫共沉淀等方法證實在大鼠心肌缺血模型中，M3與Cx43共定位關(guān)系減弱，可出現(xiàn)室性心律失常發(fā)生率及持續(xù)時間增加，其機制可能是二者發(fā)生脫偶聯(lián)，進而造成細胞間電信號轉(zhuǎn)導功能異常。提示兩者共定位關(guān)系增強可能是房顫的保護機制［15］。本研究結(jié)果顯示，在房顫患者中，M3受體與Cx43蛋白共定位關(guān)系較竇性心律患者增強，即M3受體與Cx43蛋白共定位關(guān)系發(fā)生變化。但目前其機制仍不明確，缺乏國內(nèi)外相關(guān)研究，可能與房顫發(fā)生后產(chǎn)生的繼發(fā)性保護改變有關(guān)，尚需進一步研究證實。

綜上所述，在風心伴房顫患者心肌組織中，Cx43的表達量降低可能是促進房顫發(fā)生與維持的原因之一;而M3受體表達量下降、CX43蛋白與M3受體的共定位關(guān)系增強，卻可能是房顫時心肌細胞的自我保護機制，但仍需免疫共沉淀結(jié)合Western blot檢測兩者蛋白結(jié)合度證實。

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